[發(fā)明專利]一種表達和純化Her2全長蛋白的方法以及Her2全長蛋白的應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810814041.2
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN109734799A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發(fā)明（設計）人: 王海瑤;張永頂;馬偉民
• 申請（專利權）人: 深圳市伯勞特生物制品有限公司
• 主分類號: C07K14/82
• 分類號: C07K14/82;C12N15/85;A01K67/033;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574
• 代理公司: 深圳市深佳知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 44285
• 代理人: 王仲凱

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫技術領域，公開了一種表達和純化Her2全長蛋白的方法以及Her2全長蛋白的應用。本發(fā)明以果蠅卵細胞作為表達Her2全長蛋白的宿主細胞，聯(lián)合適宜的昆蟲細胞表達載體、篩選方法、細胞傳代擴增方法以及蛋白純化方法組成系統(tǒng)的Her2全長蛋白表達純化方法，獲得了毫克級以上的目標蛋白，并具備較佳的抗原性和與抗Her2單抗結合的特異性，可通過夾心ELISA法有效識別血清中Her2的含量，對乳腺癌的診斷分型和預后有重要指導作用。

技術領域

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫技術領域，具體涉及一種表達和純化Her2全長蛋白的方法以及Her2全長蛋白的應用。

背景技術

乳腺癌細胞有三種重要受體：雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)和HER2。ER+癌細胞(即具有雌激素受體的癌細胞)依賴于雌激素的生長，可以用藥物治療以阻斷雌激素效應(例如他莫昔芬)，且預后較好。HER2+癌細胞用單克隆抗體曲妥珠單抗(聯(lián)合常規(guī)化療)的藥物有一定的療效，并改善了預后。不含任何這三種受體類型的乳腺癌細胞(雌激素受體，孕激素受體或HER2)被稱為三重陰性，對上述治療不敏感且預后較差。

Her2是跨膜蛋白有膜外膜中和膜內3部分組成。癌細胞裂解Her2可釋放到血清中，膜外部分可從腫瘤細胞表面脫落進入循環(huán)，這使得在血清中隊HER2的檢測可行。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測血清中的HER2被廣泛研究。

曲妥珠單抗是抗Her2的單克隆抗體，它通過將自己附著在Her2上來阻止人體表皮生長因子在Her2上的附著，從而阻斷癌細胞的生長。它可將1-3期HER2陽性乳腺癌的5年無病生存率提高到87％(總生存率95％)。通過測血清中Her2含量作為篩查乳腺癌的一種方式，不僅對身體無副作用，還能有助于預測對曲妥珠單抗治療的反應對是否采取曲妥珠單抗治療方案以直觀的指示，但曲妥珠單抗不僅昂貴且對心臟毒性有關。

Her2全長蛋白由于其特殊性，難以成功的在常規(guī)細胞中表達并純化出可用的Her2全長蛋白，目前僅有的表達Her2全長蛋白普遍是采用乳腺癌細胞株，但是采用乳腺癌細胞株表達Her2全長蛋白，只適用于一般的功能檢測和課題研究，只有納克級，而能夠表達并純化出Her2全長蛋白至少需要達到毫克級別。因此，能夠成功表達并純化出Her2全長蛋白將對檢測血清中Her2含量有很重要的意義。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種表達和純化Her2全長蛋白的方法，使得所述方法能夠成功表達并純化出Her2全長蛋白，具備較佳的抗原性，并能夠和抗Her2單抗特異性結合；

本發(fā)明的另外一個目的在于提供以上述Her2全長蛋白為基礎的乳腺癌檢測試劑盒。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種表達和純化Her2全長蛋白的方法，包括：

步驟1、合成Her2全基因，并在全基因兩端設計酶切位點，通過酶切連接至昆蟲細胞表達載體，獲得重組載體；

步驟2、將所述重組載體轉染至果蠅卵細胞中，通過篩選獲得穩(wěn)定表達Her2全長蛋白的果蠅卵細胞；

步驟3、將所述果蠅卵細胞傳代擴增至細胞濃度為2*10⁶個/ml時，離心去掉上清液，留存細胞；

步驟4、用含500uM硫酸銅誘導劑的無血清培養(yǎng)基重懸細胞，并誘導表達72小時，收集上清表達液；

步驟5、上清表達液進行Ni-NTA蛋白純化，獲得Her2全長蛋白。

針對目前缺少表達并純化出Her2全長蛋白的方法，本發(fā)明選擇果蠅卵細胞為表達載體，并制定了一套與之相適宜的表達載體和表達方法，最終表達并純化出可以直接用于ELISA檢測中的毫克級以上的Her2全長蛋白。