[發明專利]一種表達和純化Her2全長蛋白的方法以及Her2全長蛋白的應用

在審

• 申請號: 201810814041.2
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN109734799A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 王海瑤;張永頂;馬偉民
• 申請（專利權）人: 深圳市伯勞特生物制品有限公司
• 主分類號: C07K14/82
• 分類號: C07K14/82;C12N15/85;A01K67/033;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574
• 代理公司: 深圳市深佳知識產權代理事務所(普通合伙) 44285
• 代理人: 王仲凱

1.一種表達和純化Her2全長蛋白的方法，其特征在于，包括：

步驟1、合成Her2全基因，并在全基因兩端設計酶切位點，通過酶切連接至昆蟲細胞表達載體，獲得重組載體；

步驟2、將所述重組載體轉染至果蠅卵細胞中，通過篩選獲得穩定表達Her2全長蛋白的果蠅卵細胞；

步驟3、將所述果蠅卵細胞傳代擴增至細胞濃度為2*10⁶個/ml時，離心去掉上清液，留存細胞；

步驟4、用含500uM硫酸銅誘導劑的無血清培養基重懸細胞，并誘導表達72小時，收集上清表達液；

步驟5、上清表達液進行Ni-NTA蛋白純化，獲得Her2全長蛋白。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述酶切位點為NcoI和XhoI。

3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述昆蟲細胞表達載體為攜帶pac基因和His標簽的昆蟲細胞表達載體。

4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述昆蟲細胞表達載體為pMT/Bip/V5-A。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述果蠅卵細胞傳代擴增采用Schneider果蠅培養基培養傳代擴增。

6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述無血清培養基為Schneider果蠅培養基。

7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟5為：

步驟5.1、平衡Ni-NTA柱；

步驟5.2、在上清表達液里混合Tris-buffer saline并一同加入柱子，控制流速為0.5ml/min；

步驟5.3、收集濾下的樣品，重復上一步驟1次或多次；

步驟5.4、Tris-buffer saline洗滌，同時測定OD_280nm，直到沒有蛋白流出為止；

步驟5.5、Tris-buffer saline洗雜，收集濾液，直至OD_280nm測定沒有蛋白流出為止；

步驟5.6、Tris-buffer saline洗脫，收集每管洗脫液，測定OD_280nm并電泳檢測所收集的洗脫液，檢測出目標蛋白，然后透析獲得Her2全長蛋白。

8.一種乳腺癌夾心ELISA法檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-7任意一項所述方法制備的Her2全長蛋白。

9.根據權利要求8所述試劑盒，其特征在于，還包括如下組分的一種或兩種以上：

包被有抗Her2單克隆抗體1的載體、PBS-T、連接酶HRP的抗Her2的單克隆抗體2和TMB。

10.一種檢測Her2含量的方法，其特征在于，包括：

步驟1、將權利要求1-7任意一項所述方法制備的Her2全長蛋白分別稀釋為100ng/100ul、80ng/100ul、60ng/100ul、40ng/100ul梯度濃度，0ng/100ul作為陰性對照，包被有抗Her2單克隆抗體1的載體上每個孔加入梯度濃度樣本100ul，做復孔，室溫2小時孵育；

步驟2、用PBS-T洗滌，加連接酶HRP的抗Her2的單克隆抗體2，室溫1小時孵育；

步驟3、用PBS-T洗滌，加酶底物TMB顯色10分鐘，測OD_450nm值，繪制標準曲線，待用；

步驟4、加待測血清至包被有抗Her2單克隆抗體1的載體上，室溫2小時孵育；

步驟5、用PBS-T洗滌，加連接酶HRP的抗Her2的單克隆抗體2，室溫1小時孵育；

步驟6、用PBS-T洗滌，加酶底物TMB顯色10分鐘，測OD_450nm值，代入到步驟3中的標準曲線，獲得待測血清中Her2含量。