[發(fā)明專利]一種基于數(shù)字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810812149.8
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN108841927A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇本玉;王一村;許士明;周莉莉;高翠玲;李娜;侯廣月;高靜靜
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京中濟(jì)緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 馬國冉

本發(fā)明公開了一種基于數(shù)字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該方法首先確定出在一定質(zhì)量范圍內(nèi)阿膠質(zhì)量與DNA濃度含量的線性關(guān)系以及在一定濃度范圍內(nèi)DNA質(zhì)量含量與DNA絕對拷貝數(shù)的線性關(guān)系，以DNA含量為中間換算值，從而換算出阿膠質(zhì)量與DNA絕對拷貝數(shù)的線性關(guān)系，利用ddPCR檢測出待測樣品的絕對拷貝數(shù)來確定阿膠及阿膠制品中阿膠的絕對含量。有益效果：本申請利用ddPCR對待測樣品進(jìn)行DNA拷貝數(shù)的精確計數(shù)，定量結(jié)果準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定，能有效對市售的各類阿膠產(chǎn)品進(jìn)行定量檢測和純度鑒定，有較大的應(yīng)用價值和應(yīng)用前景，可有效預(yù)防阿膠摻假現(xiàn)象的發(fā)生。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于數(shù)字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

阿膠是采用馬科動物驢的鮮皮或干燥皮經(jīng)去毛漂泡、煎煮、濃縮、并加入各類輔料制成的固體膠類藥物，也被稱為驢皮膠。其與人參、鹿茸三者一起被稱為“中藥三寶”，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品。阿膠具有滋陰補血，潤燥，止血的功效，其補血功效已被證實。除補血外，阿膠在增強免疫力、抗疲勞、抗輻射、抑制腫瘤、保護(hù)大腦、促進(jìn)骨愈合生長以及保護(hù)心血管等方面的功效都已被證實。由于其重要性，阿膠產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已融入健康中國發(fā)展戰(zhàn)略。

目前，阿膠行業(yè)進(jìn)入了空前的發(fā)展期，市場增幅逐年提高，從而讓驢皮處于供不應(yīng)求的局面。然而，我國驢存量逐年下降，行業(yè)驢皮資源緊張，原料供應(yīng)嚴(yán)重不足。在巨大利益的誘惑下，以其他動物廉價皮甚至工業(yè)明膠冒充驢皮等故意制假售假現(xiàn)象嚴(yán)重。這種方式熬制出來的“假阿膠”雖在外觀、氣味、質(zhì)地、口感等方面與真阿膠無明顯差異，但阿膠純度低。有些摻假阿膠甚至威脅人體健康，嚴(yán)重擾亂了阿膠市場秩序。當(dāng)前，阿膠的真假鑒別和純度鑒定是該行業(yè)急需解決的瓶頸難題。

為解決阿膠行業(yè)存在的種種問題，辨別阿膠真?zhèn)危S多學(xué)者已做了大量卓越的工作，開創(chuàng)了各類檢測方法，包括高效液相色譜法、高效液相質(zhì)譜法、光譜法、酶聯(lián)免疫法、電泳法以及分子生物學(xué)方法等。這些方法能有效辨別阿膠是否摻假，但無法對阿膠純度進(jìn)行評估，因此依然無法對阿膠的品質(zhì)進(jìn)行評價。要從根本上解決阿膠行業(yè)存在的問題，不僅要進(jìn)行定性分析，更重要的是對阿膠定量分析。由于技術(shù)上的難點，目前行業(yè)內(nèi)阿膠定量分析研究極少，幾乎處于研究空白。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明提供了一種基于數(shù)字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法。該方法可實現(xiàn)阿膠的絕對定量，準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定，可對市場上阿膠產(chǎn)品進(jìn)行純度測定，從而突破現(xiàn)階段無法對阿膠及其相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行純度評價的難題。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種基于數(shù)字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法，包括以下步驟：

(1)純品阿膠質(zhì)量與DNA濃度含量測定及關(guān)系確定：分別提取不少于10個質(zhì)量梯度的阿膠標(biāo)準(zhǔn)品DNA，每個質(zhì)量梯度重復(fù)3次；并利用紫外分光光度核酸定量測定儀測定標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度，確定出在一定質(zhì)量范圍內(nèi)的純品阿膠質(zhì)量與DNA濃度含量的線性關(guān)系，并列出純品阿膠質(zhì)量與DNA濃度含量關(guān)系方程式為y＝ax±b，相關(guān)系數(shù)需滿足R²≥0.990，其中y是阿膠DNA濃度含量(ng/μL)，x是純品阿膠質(zhì)量(mg)；

(2)阿膠DNA質(zhì)量含量與目的基因拷貝數(shù)測定及關(guān)系確定：在數(shù)字PCR檢測的濃度范圍內(nèi)，分別稀釋至并選取10個質(zhì)量梯度的阿膠標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，每個濃度梯度重復(fù)3次；確定出在一定的阿膠DNA濃度范圍內(nèi)，DNA質(zhì)量含量與目的基因拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，并列出關(guān)系方程式為Y＝cX±d，相關(guān)系數(shù)需滿足R²≥0.990，其中Y是目的基因拷貝數(shù)(copies/μL)，X為反應(yīng)體系中阿膠DNA質(zhì)量含量(ng)；