[發明專利]一種基于數字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法

在審

• 申請號: 201810812149.8
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN108841927A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 蘇本玉;王一村;許士明;周莉莉;高翠玲;李娜;侯廣月;高靜靜
• 申請（專利權）人: 山東省產品質量檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 馬國冉

本發明公開了一種基于數字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法，屬于分子生物學技術領域。該方法首先確定出在一定質量范圍內阿膠質量與DNA濃度含量的線性關系以及在一定濃度范圍內DNA質量含量與DNA絕對拷貝數的線性關系，以DNA含量為中間換算值，從而換算出阿膠質量與DNA絕對拷貝數的線性關系，利用ddPCR檢測出待測樣品的絕對拷貝數來確定阿膠及阿膠制品中阿膠的絕對含量。有益效果：本申請利用ddPCR對待測樣品進行DNA拷貝數的精確計數，定量結果準確、高效、穩定，能有效對市售的各類阿膠產品進行定量檢測和純度鑒定，有較大的應用價值和應用前景，可有效預防阿膠摻假現象的發生。

技術領域

本發明涉及一種基于數字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

阿膠是采用馬科動物驢的鮮皮或干燥皮經去毛漂泡、煎煮、濃縮、并加入各類輔料制成的固體膠類藥物，也被稱為驢皮膠。其與人參、鹿茸三者一起被稱為“中藥三寶”，首載于《神農本草經》，并被列為上品。阿膠具有滋陰補血，潤燥，止血的功效，其補血功效已被證實。除補血外，阿膠在增強免疫力、抗疲勞、抗輻射、抑制腫瘤、保護大腦、促進骨愈合生長以及保護心血管等方面的功效都已被證實。由于其重要性，阿膠產業現已融入健康中國發展戰略。

目前，阿膠行業進入了空前的發展期，市場增幅逐年提高，從而讓驢皮處于供不應求的局面。然而，我國驢存量逐年下降，行業驢皮資源緊張，原料供應嚴重不足。在巨大利益的誘惑下，以其他動物廉價皮甚至工業明膠冒充驢皮等故意制假售假現象嚴重。這種方式熬制出來的“假阿膠”雖在外觀、氣味、質地、口感等方面與真阿膠無明顯差異，但阿膠純度低。有些摻假阿膠甚至威脅人體健康，嚴重擾亂了阿膠市場秩序。當前，阿膠的真假鑒別和純度鑒定是該行業急需解決的瓶頸難題。

為解決阿膠行業存在的種種問題，辨別阿膠真偽，許多學者已做了大量卓越的工作，開創了各類檢測方法，包括高效液相色譜法、高效液相質譜法、光譜法、酶聯免疫法、電泳法以及分子生物學方法等。這些方法能有效辨別阿膠是否摻假，但無法對阿膠純度進行評估，因此依然無法對阿膠的品質進行評價。要從根本上解決阿膠行業存在的問題，不僅要進行定性分析，更重要的是對阿膠定量分析。由于技術上的難點，目前行業內阿膠定量分析研究極少，幾乎處于研究空白。

發明內容

為解決上述技術難題，本發明提供了一種基于數字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法。該方法可實現阿膠的絕對定量，準確、高效、穩定，可對市場上阿膠產品進行純度測定，從而突破現階段無法對阿膠及其相關產品進行純度評價的難題。

本發明是通過以下技術方案實現：

一種基于數字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法，包括以下步驟：

(1)純品阿膠質量與DNA濃度含量測定及關系確定：分別提取不少于10個質量梯度的阿膠標準品DNA，每個質量梯度重復3次；并利用紫外分光光度核酸定量測定儀測定標準品DNA濃度，確定出在一定質量范圍內的純品阿膠質量與DNA濃度含量的線性關系，并列出純品阿膠質量與DNA濃度含量關系方程式為y＝ax±b，相關系數需滿足R²≥0.990，其中y是阿膠DNA濃度含量(ng/μL)，x是純品阿膠質量(mg)；

(2)阿膠DNA質量含量與目的基因拷貝數測定及關系確定：在數字PCR檢測的濃度范圍內，分別稀釋至并選取10個質量梯度的阿膠標準品DNA進行數字PCR檢測，每個濃度梯度重復3次；確定出在一定的阿膠DNA濃度范圍內，DNA質量含量與目的基因拷貝數之間的線性關系，并列出關系方程式為Y＝cX±d，相關系數需滿足R²≥0.990，其中Y是目的基因拷貝數(copies/μL)，X為反應體系中阿膠DNA質量含量(ng)；