[發(fā)明專利]一種基于數(shù)字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810812149.8
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN108841927A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇本玉;王一村;許士明;周莉莉;高翠玲;李娜;侯廣月;高靜靜
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京中濟(jì)緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 馬國冉

1.一種基于數(shù)字PCR的阿膠及阿膠制品中阿膠成分的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟

(1)純品阿膠質(zhì)量與DNA濃度含量測定及關(guān)系確定：分別提取不少于10個質(zhì)量梯度的阿膠標(biāo)準(zhǔn)品DNA，每個質(zhì)量梯度重復(fù)3次；并利用紫外分光光度核酸定量測定儀測定標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度，確定出在一定質(zhì)量范圍內(nèi)的純品阿膠質(zhì)量與DNA濃度含量的線性關(guān)系，并列出純品阿膠質(zhì)量與DNA濃度含量關(guān)系方程式為y＝ax±b，相關(guān)系數(shù)需滿足R²≥0.990，其中y是阿膠DNA濃度含量，單位ng/μL；x是純品阿膠質(zhì)量，單位mg；

(2)阿膠DNA質(zhì)量含量與目的基因拷貝數(shù)測定及關(guān)系確定：在數(shù)字PCR檢測的濃度范圍內(nèi)，分別稀釋至并選取10個質(zhì)量梯度的阿膠標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，每個濃度梯度重復(fù)3次；確定出在一定的阿膠DNA濃度范圍內(nèi)，DNA質(zhì)量含量與目的基因拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，并列出關(guān)系方程式為Y＝cX±d，相關(guān)系數(shù)需滿足R²≥0.990，其中Y是目的基因拷貝數(shù)，單位copies/μL；X為反應(yīng)體系中阿膠DNA質(zhì)量含量，單位ng；

(3)純品阿膠質(zhì)量與目的基因拷貝數(shù)關(guān)系確定：根據(jù)步驟(1)確立的純品阿膠質(zhì)量與阿膠DNA濃度含量之間的關(guān)系，以及步驟(2)確立的阿膠DNA質(zhì)量含量與目的基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系，以阿膠DNA含量為中間過渡換算值，確定出純品阿膠質(zhì)量與目的基因拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，并列出關(guān)系方程式為M_阿膠＝eC±f；其中，M_阿膠為純品阿膠質(zhì)量，單位mg；C為每微升的目的基因拷貝數(shù)，單位copies/μL；

DNA濃度含量和質(zhì)量含量的中間過渡關(guān)系式為X＝v*y/n，其中v為擴(kuò)增體系中DNA的上樣體積，n為DNA模板的稀釋倍數(shù)；

(4)待測阿膠產(chǎn)品的定量確定：利用數(shù)字PCR檢測待測樣品中基因拷貝數(shù)，采用步驟(3)所述關(guān)系式換算出相應(yīng)純品的阿膠理論質(zhì)量，所述阿膠的理論質(zhì)量與進(jìn)行DNA提取的阿膠總質(zhì)量的比值即為待測阿膠的純度。

2.如權(quán)利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述數(shù)字PCR的擴(kuò)增體系為：采用20μL體系，上下游引物各1.8μL，探針0.8μL，數(shù)字PCR Mix 10μL，模板4μL，無菌水補(bǔ)齊至20μL；利用微滴生成器將20μL反應(yīng)液生成不低于15000個DNA模板和試劑隨機(jī)分布的微滴；數(shù)字PCR反應(yīng)程序如下：95℃10min；94℃30s；60℃1min；98℃10min；40個循環(huán)，4℃保存，最后用微滴分析儀對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。