[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于InDel分子標(biāo)記鑒定辣椒雄性不育三系配套雜交種真實(shí)性和純度的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810811212.6
• 申請(qǐng)日: 2018-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108893555B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林多;王莉月;王輝;馬靜;楊延杰;代佳汐;劉建萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

1.一種基于InDel分子標(biāo)記鑒定辣椒雄性不育三系配套雜交種真實(shí)性和純度的方法，其特征在于所述鑒定方法包括以下步驟：

（1）將待鑒定的辣椒雜交種和其親本的種子同時(shí)進(jìn)行培育，直至培育成芽苗；

（2）提取芽苗期的辣椒待測(cè)材料的DNA；

（3）InDel-PCR擴(kuò)增：使用核心InDel引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能在PCR結(jié)果中擴(kuò)增出共顯性標(biāo)記，則待鑒定雜交種為真實(shí)性雜交種；

所述核心InDel引物為：CIDH28、CIDH825、CIDH848、CIDH8、CIDH293、CIDH440、CIDH800、CIDH776、CIDH360、CIDH580、CIDH5、CIDH602、CIDH131、CIDH373、CIDH302、CIDH426、CIDH267、CIDH307、CIDH200、CIDH634、CIDH325、CIDH351、CIDH859、CIDH908、CIDH202；

如果無(wú)法擴(kuò)增出共顯性標(biāo)記，則結(jié)合次級(jí)核心InDel引物繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果出現(xiàn)共顯性標(biāo)記，則待鑒定雜交種為真實(shí)性雜交種；

所述次級(jí)核心InDel引物為：CIDH569、CIDH110、CIDH864、CIDH261、CIDH438、CIDH423、CIDH27、CIDH170、CIDH763、CIDH762、CIDH694、CIDH70、CIDH112、CIDH565、CIDH951、CIDH640、CIDH209、CIDH937、CIDH769、CIDH131、CIDH602；

（4）雜交種純度鑒定：選擇核心InDel引物和次級(jí)核心InDel引物中確定的辣椒雜交種真實(shí)性鑒定所應(yīng)用的共顯性標(biāo)記對(duì)應(yīng)的共顯性引物，對(duì)待純度鑒定的辣椒雜交種單株編號(hào)和取樣，取樣≧100株；雜交種單株提取DNA后進(jìn)行電泳檢測(cè)；若雜交種單株出現(xiàn)共顯性標(biāo)記，則為真實(shí)性雜交種，反之為假雜種，辣椒雜交種純度=具有目的共顯性標(biāo)記的株數(shù)/待鑒定的總株數(shù)×100%。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：所述次級(jí)核心InDel引物定位于6號(hào)染色體的辣椒育性相關(guān)主效基因相關(guān)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：所述步驟（1）中是取待鑒定的雜交種及親本的種子先進(jìn)行溫湯浸種，然后常溫浸泡；然后在光照下催芽培養(yǎng)7-10天。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：所述步驟（4）中純度鑒定是在種子發(fā)芽后將種子移植至72孔穴盤(pán)中，單株標(biāo)記，基質(zhì)為發(fā)酵菇渣，置于光照培養(yǎng)箱中，白天28℃，夜晚16℃，繼續(xù)培養(yǎng)5-15天，然后提取DNA檢測(cè)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：所述步驟（3）中PCR反應(yīng)體系為模板DNA2μl，正反引物各1μl，2×Go Taq R Colorless Master Mix7.5μl，用ddH₂O補(bǔ)充至15μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：所述步驟（3）中PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃總延伸5min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：所述辣椒為加工型辣椒。