[發明專利]一種構建結構開關型核酸適配體的通用方法及應用其的通用型傳感器和其構建方法

有效

• 申請號: 201810807459.0
• 申請日: 2018-07-21
• 公開（公告）號: CN110734957B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 婁新徽;黃旸
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G01N33/531;G01N33/53
• 代理公司: 北京展翅星辰知識產權代理有限公司 11693
• 代理人: 王文生

本發明涉及一種構建結構開關型核酸適配體的通用方法，以及應用其檢測多種類型靶標的通用型傳感器。通過將核酸適配體的兩端分別連接富含鳥嘌呤核苷酸(G)的序列來構建具有結構開關性能的探針(Apt?G4)。當沒有能夠與核酸適配體特異性結合的靶標存在時，Apt?G4形成G?四聚體結構(G4)；當有靶標存在時，靶標與核酸適配體結合，G4被破壞。Apt?G4設計對不同類型靶標的核酸適配體具有普適性。利用G4可以顯著增強氯化血紅素催化H₂O₂與無色的2'?聯氨?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸(ABTS)反應生成綠色ABTS^+·的性質，分別實現對汞離子、凝血酶和磺胺地索辛的信號減型的比色檢測。

技術領域

本發明涉及一種構建結構開關型核酸適配體的通用方法，以及應用其檢測多種類型靶標(金屬離子、蛋白質、有機小分子)的通用型傳感器和其構建方法。屬于生物技術領域。

背景技術

核酸適配體是通過體外篩選技術，即指數富集配體系統進化技術(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)(Nature,1990,346(6287),818-822；Science,1990,249(4968),505-510)，從體外合成的寡核苷酸文庫中，通過多輪的親和富集和聚合酶鏈式反應等步驟獲得的，對篩選靶標具有高的特異性和親和力的生物識別分子。核酸適配體可以識別多種類型的靶標，包括金屬離子、蛋白質、有機小分子等等。核酸適配體在多個領域得到了廣泛的應用，特別是生物傳感器領域。

結構開關型核酸適配體(SSA)是一類與靶標結合時能夠發生顯著構象變化的核酸適配體。由于其靶標誘導的構象變化可以方便地轉化成為可以檢測的電化學、光學等信號，在生物傳感領域引起了極大的興趣。近些年來基于SSA的傳感器層出不窮，具有結構簡單、操作簡單、靈敏度高和特異性好的顯著優點。但是目前篩選SSA的方法非常少，效率低(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,14053-14058.)，需要15-20個篩選循環，而且獲得的核酸適配體選擇性差、親和力低。目前報道的SSA數量非常有限，絕大多數核酸適配體不具有或者僅具有微小的構象變化，因而靶標與核酸適配體結合時不能夠誘導產生顯著的檢測信號的變化。而且不同靶標的SSA往往具有不同的結構開關方式，比如SSA與靶標結合可以形成雙鏈、Y型、G-四聚體等等不同的結構，缺乏統一性，也限制了通用性SSA傳感器的設計。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一種構建結構開關型核酸適配體的通用方法，以及應用其檢測多種類型靶標(金屬離子、蛋白質、有機小分子)的通用型傳感器。

本發明提供的一種構建結構開關型核酸適配體的通用方法，其中包括如下步驟：設計具有結構開關性能的核酸適配體：將核酸適配體的兩端分別連接富含鳥嘌呤核苷酸G的序列來構建具有結構開關性能的探針Apt-G4。

進一步，上述構建結構開關型核酸適配體的通用方法中，所述具有結構開關性能的探針Apt-G4為A-SULF-A；A-TBA29-A；和A-T11-A。

另外，本發明還提供一種通用型傳感器的構建方法，包括：步驟(1)設計具有結構開關性能的核酸適配體：將核酸適配體的兩端分別連接富含鳥嘌呤核苷酸G的序列來構建具有結構開關性能的探針Apt-G4；步驟(2)95℃加熱Apt-G4，緩冷至室溫；步驟(3)加入不同濃度的待測物質與Apt-G4孵育形成混合液；步驟(4)加入氯化血紅素(hemin)與上述混合液孵育；步驟(5)同時加入過氧化氫與2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，測定選定時間的418nm處的紫外吸收，以紫外吸收值為縱坐標，待測物質的濃度為橫坐標繪制工作曲線。

另外，上述通用型傳感器的構建方法中，步驟(2)中，95℃恒溫加熱6分鐘，然后緩冷至25℃。