[發(fā)明專利]一種牛源性抗金黃色葡萄球菌融合抗體scFv-Fc及其制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810801037.2 | 申請日： | 2018-07-20 |
| 公開（公告）號： | CN109021109A | 公開（公告）日： | 2018-12-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 朱建國;王曼;王婷婷;王鳳青;張波 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海交通大學(xué) |
| 主分類號： | C07K16/46 | 分類號： | C07K16/46;C12N15/73;A61K39/40;A61P31/04;A61P15/14;G01N33/569 |
| 代理公司： | 上海恒慧知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 31317 | 代理人： | 張寧展 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 抗體 融合 氨基酸序列 抗金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌 輕鏈可變區(qū) 重鏈可變區(qū) 制備 金黃色葡萄球菌抗原 體外抑菌試驗 奶牛乳腺炎 特異性結(jié)合 吞噬細(xì)胞 吞噬作用 中間連接 外周血 調(diào)理 介導(dǎo) 奶牛 診斷 生長 預(yù)防 治療 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明公開了一種牛源性抗金黃色葡萄球菌融合抗體scFv?Fc及其制備方法。該融合抗體scFv?Fc至少具有如SEQ ID No：1所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)、如SEQ ID No：2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和位于輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間的中間連接肽以及如SEQ ID No：3所示氨基酸序列的Fc片段。ELISA結(jié)果顯示，該融合抗體能和金黃色葡萄球菌抗原特異性結(jié)合；在體外抑菌試驗中，該融合抗體在24h內(nèi)能完全抑制金黃色葡萄球菌的生長；且該融合抗體能介導(dǎo)奶牛外周血吞噬細(xì)胞發(fā)揮調(diào)理吞噬作用。該融合抗體在用于診斷、預(yù)防及治療金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相關(guān)試劑或藥物中，具有良好的應(yīng)用前景。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種牛源性抗金黃色葡萄球菌融合抗體scFv-Fc及其制備方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
奶牛乳腺炎是指奶牛乳腺組織的炎癥，它是影響奶牛業(yè)發(fā)展，給乳品生產(chǎn)帶來巨大損失的一種常見多發(fā)病。引起奶牛乳腺炎的病原菌很多，其中金黃色葡萄球菌是最重要的致病菌。由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎一方面主要采用抗生素治療，但此治療方法導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)得越來越多，而且抗性奶對人類的健康也帶來了一定的威脅；另一方面主要采用疫苗，目前有很多針對金黃色葡萄球菌活的或者滅活的菌體，分離的黏附素、毒素和多糖等毒力因子制作的疫苗出現(xiàn)，可能由于細(xì)菌抗原的變異使致病因子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這些疫苗的治療效果均不理想。因為疫苗的作用機(jī)理是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，所以抗體制劑也許能對其感染起到一定的預(yù)防和治療的作用。
單鏈抗體是一種基因工程抗體，通過DNA重組技術(shù)將抗體輕鏈可變區(qū)VL和重鏈可變區(qū)VH通過一段連接短肽linker首尾連接而成，是保留完整抗原結(jié)合部位的最小功能片段。IgG分子的Fc片段包含有鉸鏈區(qū)(Hinge)，重鏈恒定區(qū)2(Heavy chain constantregion,CH2)和重鏈恒定區(qū)3(Heavy chain constant region,CH3)，鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)域可以維持IgG分子的穩(wěn)定性，CH2區(qū)域在IgG Fc片段發(fā)揮功能方面有著重要作用。融合抗體scFv-Fc既能與抗原結(jié)合，又具有Fc片段介導(dǎo)的吞噬細(xì)胞的調(diào)理吞噬作用，且可以進(jìn)行原核和真核表達(dá)并大規(guī)模工程化制備，顯示了巨大的應(yīng)用潛力，越來越受到人們的重視。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛源抗金黃色葡萄球菌融合抗體scFv-Fc，該融合抗體能夠與金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合，具有一定的抑菌活性，且能介導(dǎo)外周血吞噬細(xì)胞發(fā)揮調(diào)理吞噬作用，能夠用于金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎的診斷、預(yù)防和/或治療。
一種抗金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎的融合抗體scFv-Fc，其至少具有如SEQ IDNo：1所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)、如SEQ ID No：2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和位于輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間的中間連接肽，以及如SEQ ID No：3所示氨基酸序列的Fc片段。
上述中間連接肽為GGGGSGGGGSGGGGS。
上述融合抗體scFv-Fc具有如SEQ ID No：4所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的再一目的是提供一種上述牛源性抗金黃色葡萄球菌融合抗體scFv-Fc的制備方法，包括以下步驟：
(1)采用RT-PCR直接從患奶牛乳腺炎的外周血單個淋巴細(xì)胞RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；
(2)利用SOE-PCR法將linker與VH基因和VL基因相連構(gòu)建牛源性單鏈抗體基因；
(3)將步驟(2)的牛源性單鏈抗體基因克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；
(4)將步驟(3)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，培養(yǎng)并用輔助噬菌體擴(kuò)增建立初級單鏈抗體文庫；
(5)用金黃色葡萄球菌全菌作為包被抗原，富集淘選四輪；
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