[發明專利]一種法夫酵母細胞機械破壁的方法

在審

• 申請號: 201810795767.6
• 申請日: 2018-07-19
• 公開（公告）號: CN108865891A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 李紀豐;石英杰;孫常明;華曉曼;蔣海燕;足立勝
• 申請（專利權）人: 威海利達生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/06
• 分類號: C12N1/06;C12R1/645
• 代理公司: 北京志霖恒遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11435
• 代理人: 孟阿妮

本發明公開了一種法夫酵母細胞機械破壁的方法，具體為：法夫酵母發酵液1?4L在5000?10000rpm下離心5?10min后保留沉淀；再加入與離心前發酵液等體積的蒸餾水混勻后離心；將沉淀進行稱重后用蒸餾水將濃度稀釋至20?50％，調節pH為5?8；在壓力70?100Mpa，往復泵單次流量5?8mL，往復泵伸出速度20?50次/min的條件下，將菌液通過高壓均質機進行破壁2?5次；顯微鏡觀察菌液中細胞全部破壁后離心，向沉淀中添加100?1000mL有機溶劑萃取細胞內容物。本發明工藝簡單，易于操作，破壁速度快，節約時間，可連續生產，適用于法夫酵母胞內蝦青素、多糖、氨基酸和多肽的提取。

技術領域

本發明涉及一種方法，尤其涉及一種法夫酵母細胞機械破壁的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

法夫酵母最初是二十世紀七十年代從日本及阿拉斯加落葉植物的分泌物中分離得到的。法夫酵母通過代謝能夠產天然蝦青素，蝦青素是動物中廣泛存在的一種非維生素A源的類胡蘿卜素，被證實廣泛存在于蝦、蟹及其他各類水產品中的天然產物，具有顯色、抗氧化和增強免疫力等作用。天然蝦青素的來源主要有3種：水產品的廢棄物(蝦蟹等甲殼類)、紅法夫酵母和微藻(雨生紅球藻)。水產品廢棄物中蝦青素含量較低，與之相比雨生紅球藻細胞中的蝦青素含量最高，可達細胞干重的5％，但雨生紅球藻細胞的培養周期長，生產設備復雜，需要光照等條件限制而無法大規模生產。而通過法夫酵母發酵生產蝦青素，具有生長速度快、發酵周期短、發酵工藝簡單、易于控制、可進行高密度培養等優點，受到越來越多的關注。

法夫酵母破壁就是對法夫酵母細胞壁進行破碎，釋放出里面的營養物質，從而便于蝦青素的提取。目前常見的酵母破壁方法有酶法、超聲波法和自溶法等，但是以上方法工藝復雜、耗時較長、細胞破碎不徹底使收集不完全、不能連續生產從而不能進一步工業化。

發明內容

為了解決上述技術所存在的不足之處，本發明提供了一種法夫酵母細胞機械破壁的方法。

為了解決以上技術問題，本發明采用的技術方案是：一種法夫酵母細胞機械破壁的方法，由以下步驟組成：

步驟一，法夫酵母發酵液1-4L在5000-10000rpm下離心5-10min，以充分將發酵液中固體物質以及細胞內含物與水分進行分離，然后棄掉上清液，保留沉淀；

步驟二，向沉淀中加入與步驟一中離心前發酵液相同體積的蒸餾水混勻，以清洗菌體表面，降低細胞破壁時的雜質，在5000-10000rpm下離心5-10min后棄掉上清液，保留沉淀；

步驟三，將離心后的沉淀進行稱重，稱重后加入蒸餾水將濃度稀釋至20- 50％，充分混勻，調節pH 5-8；

步驟四，在壓力70-100Mpa、往復泵單次流量5-8mL、往復泵伸出速度20-5 次/min的條件下，將稀釋后菌液通過高壓均質機進行機械破壁2-5次；

步驟五，顯微鏡觀察菌液中革蘭氏染色后的細胞破壁情況；若仍存在完整的細胞壁，重復步驟四，直至所有細胞均破壁完成；

步驟六，在5000-10000rpm下離心5-10min后棄掉上清液，向沉淀中添加 100-1000mL的有機溶劑，依據相似相容原理對細胞內含物進行萃取。

進一步地，革蘭氏染色方法為：涂片固定；草酸銨結晶紫染色1min；蒸餾水沖洗；碘液覆蓋1min；蒸餾水沖洗，吸水紙吸去水分；95％酒精脫色30s；番紅染色液染色10s，蒸餾水沖洗，干燥。

進一步地，有機溶劑為大豆油、花生油、玉米油、菜籽油、葵花油、調和油、橄欖油、甘油、石油醚、丙酮、異丙醇、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一種或多種的組合。

進一步地，所述方法適用于對無性型法夫酵母細胞以及有性型法夫酵母細胞進行機械破壁。