[發明專利]用于POCT熒光RT-PCR體系的單體系酶擴增組合物的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201810794915.2
• 申請日: 2018-07-19
• 公開（公告）號: CN108866156A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 孫明;喬明明;陳西釗;田克恭;吳培星;李文姝;王靜;陳曦
• 申請（專利權）人: 北京世紀元亨動物防疫技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 向群

本發明“用于POCT熒光RT?PCR體系的單體系酶擴增組合物的制備方法及其應用”屬于試劑盒檢測技術領域。所述制備方法包括：按如下配方配制反應液：pH值8.3～8.7的Tris?HCl反應緩沖液20～50mM、MgCl₂1～3mM、KCl 40～50mM、dNTPs 50～200μM、dUTP 100～400μM、反轉錄酶100～200U/μl、Taq酶0.8～2.8U/μl、RNA酶抑制劑10.5U/T～12.5U/T、引物0.1～1μM、探針0.01～0.2μM、終濃度為1～20Mm或體積比0.05％～10％的反應增強劑、其余為無菌無核酸酶水。

技術領域

本發明屬于試劑盒檢測技術領域，涉及用于POCT熒光RT-PCR體系的單體系酶擴增組合物的制備方法及其應用。

背景技術

目前檢測試劑盒主要有酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒、普通聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time FQ RT-PCR)試劑盒。病毒、細菌、寄生蟲的常規臨床及實驗室檢測鑒定方法有鏡檢、病原分離、免疫組化、血清學診斷以及分子生物學方法。其中實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time FQ RT-PCR)試劑盒具有耗時短、靈敏度高、特異性強的優點。

現在市場上常見的實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time FQ RT-PCR)擴增試劑盒包括反應液(含引物探針)、酶混合液、無菌無核酸酶水，進行實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增時，先按照說明書比例配制各種試劑的混合液，然后再分裝到每個反應管中。現在市場上應用的實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time FQ RT-PCR)擴增試劑盒存在以下不足：一、擴增體系配制錯誤，導致結果錯誤；二、試劑盒組分包括反應液(含引物探針)、酶混合液、無菌無核酸酶水等，檢測前須按照說明書比例配制預混液，再進行分裝。容易造成配液錯誤、污染，并且預混液需現配現用，操作繁瑣且耗時較長；三、常見的實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應擴增試劑盒反應時間通常需要1～2小時，耗時長，難以滿足大批量檢測的需求。

POCT(point-of-care testing)，指即時檢驗、現場快速檢驗，指在病人旁邊進行的臨床檢測及床邊檢測(bedside testing)，通常不一定是臨床檢驗師來進行。是在采樣現場即刻進行分析，省去標本在實驗室檢驗時的復雜處理程序，快速得到檢驗結果的一類新方法。

POCT由中國醫學裝備協會POCT裝備技術專業委員會在多次專家論證基礎上統一命名，并將其定義為：在采樣現場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結果的一種檢測方式。POCT含義可從兩方面進行理解：空間上，在患者身邊進行的檢驗，即“床旁檢驗”；時間上，可進行“即時檢驗”。

目前，限制POCT檢測模式在PCR檢測領域的應用的主要制約因素有：常規PCR或熒光PCR需現場配液、操作繁瑣、耗時較長、不穩定、易污染等。

因此，亟需一種穩定性好、保存期長、操作簡便、不需配液(提取好模板直接加入擴增體系)、檢測時間短的POCT熒光RT-PCR體系的單體系酶擴增組合物的制備方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種用于POCT熒光RT-PCR體系的單體系酶擴增組合物及其制備方法，該方法制得的單體系酶擴增組合物穩定性好、保存期長、操作簡便、不需配液(提取好模板直接加入擴增體系)，且RT-PCR擴增時間僅需30分鐘(常規試劑盒的RT-PCR擴增時間在70分鐘以上)，使檢測時間相比常規檢測減少了75％～80％，并且可大大減少試驗出錯及污染的可能性，非常適用于POCT檢測模式。

本發明的技術方案如下：

用于POCT熒光RT-PCR體系的單體系酶擴增組合物的制備方法，其特征在于，包括：

(1)針對目標序列設計并合成特異性的引物和探針；