[發明專利]用于POCT熒光RT-PCR體系的單體系酶擴增組合物的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201810794915.2
• 申請日: 2018-07-19
• 公開（公告）號: CN108866156A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 孫明;喬明明;陳西釗;田克恭;吳培星;李文姝;王靜;陳曦
• 申請（專利權）人: 北京世紀元亨動物防疫技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 向群

1.用于POCT熒光RT-PCR體系的單體系酶擴增組合物的制備方法，其特征在于，包括：

(1)針對目標序列設計并合成特異性的引物和探針；

(2)按如下配方配制反應液：

pH值8.3～8.7的Tris-HCl反應緩沖液20～50mM、MgCl₂ 1～3mM、KCl 40～50mM、dNTPs50～200μM、dUTP 100～400μM、反轉錄酶100～200U/μl、Taq酶0.8～2.8U/μl、RNA酶抑制劑10.5U/T～12.5U/T、引物0.1～1μM、探針0.01～0.2μM、終濃度為1～20Mm或體積比0.05％～10％的反應增強劑、其余為無菌無核酸酶水；

(3)將上述反應液按份分裝，每一份即所述單體系酶擴增組合物。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述反應液還包括通用內參引物0.1～1μM、內參探針0.01～0.2μM；通用內參優選Xeno RNA Control。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述反轉錄酶優選PrimeScript^TMRTEnzyme；所述Taq酶優選Takara E_X Taq^TMHS酶。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述反應增強劑選自具有下述在所述反應液中的終濃度的下述物質之一，10-20mM的硫酸銨、體積濃度為1％～5％的甲酰胺或甜菜堿、體積濃度為1％～10％的甘油、體積濃度為0.05％～0.1％的Tween-20、體積濃度為0.05％～0.1％的BSA、或，1mM～2mM的DTT或明膠。

5.根據權利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，1份單體系酶擴增組合物的總體積選自12～14μl、14～16μl、16～18μl、18～20μl、20～22μl、22～24μl或24～26μl。

6.權利要求1-5任一所述的制備方法制備得到的單體系酶擴增組合物。

7.用于POCT熒光RT-PCR體系的試劑盒，其特征在于，包括至少1份權利要求6所述的單體系酶擴增組合物。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述單體系酶擴增組合物為若干份。

9.根據權利要求7或8的試劑盒，其特征在于，所述單體系酶擴增組合物被存放在PCR擴增管中；每個PCR擴增管中存放1份所述單體系酶擴增組合物。