[發明專利]一種胃癌靶向重組免疫毒素的快速純化方法

在審

• 申請號: 201810794778.2
• 申請日: 2018-07-18
• 公開（公告）號: CN109021113A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 柳增善;李萌;王海波;胡盼;任洪林;盧士英;張嵩;馬學東
• 申請（專利權）人: 上海杵焱健康科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

本發明涉及一種胃癌靶向重組免疫毒素的快速純化方法，屬于生物工程領域。利用已構建并篩選的可高效表達可溶性rG17PE38KDEL的重組大腸菌株，優化大體積培養條件，擴大培養誘導體積至1L，1％接種量接種于LB培養基中，37℃搖培2h后加入0.5mM誘導劑IPTG，180rpm/min 16℃搖培16h，所表達蛋白65％以上為可溶狀態；通過超聲破碎法獲得可溶性蛋白后，通過三步層析方法得到較高純度與活性的重組毒素rG17PE38KDEL，獲得可用于藥物評價的具有良好活性的高純度毒素，純化過程后得到的胃癌靶向重組免疫毒素rG17PE38KDEL的純度可達95％以上，純化后重組毒素rG17PE38KDEL可以與腫瘤細胞表面CCK2R結合，并殺傷該類靶向腫瘤細胞。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種胃癌靶向重組免疫毒素的純化方法。

背景技術

胃癌是世界范圍內發病率最高的癌癥之一，也是中國的第二大常見腫瘤。手術是目前根治胃癌的唯一方法，對于中晚期患者除了進行手術治療外，常配合化療和放療等治療手段；但化療和放療的副作用太大，往往嚴重破壞病人的免疫系統，給病人造成極大痛苦。隨著抗體療法在靶向治療中的大獲成功，Moolten FL等提出了免疫毒素的概念，為癌癥的治療帶來一片光明；免疫毒素是一類由靶向分子與毒素分子連接構成的嵌合蛋白，利用抗原-抗體、細胞因子-受體的特異性結合，并基于腫瘤細胞表面特殊標志物或受體與正常細胞間的巨大差異，特異性殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無損害。近年來，隨著基因工程技術的發展，利用基因重組技術將導向的抗體片段或配體基因與毒素活性片段基因進行融合表達，純化制備得到新型重組毒素。新型重組免疫毒素具有靶向性好、殺傷能力強、毒性低、免疫原性小以及能夠大量生產等優點，具有良好的開發應用前景。

目前已有許多針對不同腫瘤靶向的重組免疫毒素進入臨床試驗階段。美國已有一種該類藥物(DAB389IL-2，ONTAK)上市，另有15種該類藥物進入I期以上的臨床試驗，國內朱平教授領導的研究小組研制的LHRH-PE40重組免疫毒素也已進入II期臨床試驗。在血液腫瘤方面，ONTAK可靶向殺傷IL-2R陽性細胞，在對144例細胞淋巴瘤患者進行的III期臨床試驗中，其中100例給予ONTAK的患者中10例完全緩解，34例部分緩解，總緩解率為44％；BL22(RFB4(dsFv)PE38)可靶向殺傷CD22陽性的淋巴瘤細胞，16例白血病患者中11例完全緩解，2例部分緩解，且完全緩解的患者中有6例在僅接受一個療程的BL22后即達到完全緩解。Anti-B4-bR可靶向殺傷CD19陽性細胞，12例B細胞非霍奇金淋巴瘤患者中11例患者在接受Anti-B4-bR治療后得到部分緩解；在實體瘤方面，SS1P[SS1(dsFv)-PE38]可以特異性殺傷間皮素高表達細胞，用于治療間皮瘤、卵巢癌和胰腺癌等間皮素高表達腫瘤患者，13例惡性間皮瘤患者在經過SS1P治療后10例得到部分緩解；IGF-I-PE40靶向癌細胞表面的胰島素樣生長因子(IGF-I)，能殺傷乳腺癌細胞、肝癌細胞。

作為活性單元的毒素分子，最常用的為白喉毒素(Diphtheria Toxin，DT)和綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin，PE)。由于成人體內大都存在DT的抗體，因此其應用受到一定的限制。PE毒素的高毒性及細胞殺傷機制已得到詳細闡述，是制備重組免疫毒素的一種理想毒素分子。PE毒素被細胞內化后發揮ADP核糖基化活性使細胞內Eef-2失活，通過阻礙蛋白質合成過程引起細胞凋亡，此外，PE毒素還可以通過其他途徑誘導細胞凋亡。但由于天然的PE毒素分子量較大且細胞穿透力不足，其被修飾和改造出現了幾種衍生物，最常用的結構有PE40KDEL和PE38KDEL，缺失Ia區使其失去細胞結合能力的同時使用KDEL序列替換REDLK，增加其內質網親和性。改良后的PE毒素分子量減小、細胞毒性和分子穿透力增加，并降低了其由于體內免疫學反應導致的副作用。此外，理論上一個重組毒素分子與腫瘤細胞結合后就可以將該細胞殺死，但由于毒素內化效率、胞內Furin酶切割效率的影響，殺死一個腫瘤細胞需要400-1000個毒素分子。這就確保了少量非特異性結合至正常細胞表面的毒素不能發揮細胞毒作用，從而保證了藥物的安全性，因此重組免疫毒素在治療腫瘤方面具有很高的價值。