[發明專利]一種鴨圓環病毒的體外增殖及培養方法

有效

• 申請號: 201810793855.2
• 申請日: 2018-07-19
• 公開（公告）號: CN108841795B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 李兆龍;黃喻;傅光華;豐志華;陳江華
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N5/078
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 林曉琴

本發明提供一種鴨圓環病毒的體外增殖及培養方法，包括如下步驟：(1)采集健康成年番鴨血，進行PBMC的分離培養，制備PBMC細胞懸液；(2)將檢測為鴨圓環病毒陽性的病料，加入到PBMC細胞懸液中培養。本發明提供了一種體外增殖培養DuCV的方法，接毒培養后病毒滴度有大幅度的提高，能夠實現在實驗室完成病毒的分離鑒定，對其致病機理及危害的研究提供較大的幫助。

技術領域

本發明涉及一種鴨圓環病毒的體外增殖及培養方法。

背景技術

鴨圓環病毒(duckcircovirus，DuCV)是圓環病毒科圓環病毒屬的新成員，可導致鴨的免疫抑制，對養鴨業造成危害。鴨圓環病毒DuCV感染的鴨子所表現的臨床癥狀主要表現為發育狀況差，并且明顯表現羽毛營養失調，在背部脊柱(的羽毛)尤其明顯，許多羽毛羽軸出血，背部皮膚組織病理學檢查主要表現為囊泡和圍繞囊泡的組織異嗜性炎性滲出，內臟器官總的病理表現為鴨傳染性漿膜炎協同感染的癥狀，對法氏囊組織病理學檢查表明，淋巴細胞損傷、壞死、組織細胞增多(Hattermann etal.,2003)。

2003年DuCV就被發現，由于該病毒大多情況下不會致宿主細胞產生可見的病變，因此病毒的體外增殖一直沒有進展，到目前尚沒有可行的體外增殖培養DuCV的方法，無法在實驗室完成病毒的分離鑒定。因此對其致病機理及危害的研究，疫苗的開發都存在很多困難，認識還非常膚淺。但目前對其流行病學的研究已經顯示該病在我國鴨群中普遍存在，借鑒其它圓環病毒已有的研究成果推測DuCV的存在可能提高鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨傳染性漿膜炎、鴨巴氏桿菌病、大腸桿菌病等鴨常發病的發病率并加重了其致病性等，所以在養鴨業規模和數量飛速發展的今天，提出一種體外增殖培養DuCV的方法刻不容緩。

發明內容

本發明要解決的技術問題，在于提供一種鴨圓環病毒的體外增殖及培養方法。

本發明是這樣實現的：

一種鴨圓環病毒的體外增殖及培養方法，包括如下步驟：

(1)采集健康成年番鴨血，進行PBMC的分離培養，制備PBMC細胞懸液；

(2)將檢測為鴨圓環病毒陽性的病料，加入到PBMC細胞懸液中培養。

進一步地，步驟(1)中，所述PBMC細胞懸液的制備方法，包括以下步驟：

A、血液采集及外周血淋巴細胞的分離

使用肝素抗凝管，采集成年番鴨血，輕微上下混勻，在無菌操作下，將鴨血與PBS按1:2混勻；取1倍體積的Ficoll淋巴細胞分離液于離心管，將鴨血與PBS的混合液緩慢加入到淋巴細胞分離液上；將離心管轉移至離心機進行離心，6000rpm/min離心20分鐘，離心結束后分層，并吸取外周血淋巴細胞層；

B、細胞培養

在無菌狀態下，吸取外周血淋巴細胞層轉移至離心管中，2000rpm/min離心5分鐘，棄去上清；用RPMI1640培養液(含10％番鴨血清)重懸細胞并轉移至培養皿中進行培養，培養條件為5％CO₂、溫度37℃、濕度100％，得到PBMC細胞懸液。

進一步地，步驟(2)中檢測鴨圓環病毒陽性，是從病料中提取鴨圓環病毒基因組DNA，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，從而檢測鴨圓環病毒陽性。

進一步地，步驟(2)中檢測為鴨圓環病毒陽性的病料，按常規方法勻漿后用PBS按1:5稀釋，然后再用0.45微米的濾膜過濾，將濾液按10％加入到PBMC細胞懸液中培養。

本發明具有如下優點：本發明提供了一種體外增殖培養DuCV的方法，接毒培養后病毒滴度有大幅度的提高，能夠實現在實驗室完成病毒的分離鑒定，對其致病機理及疫苗的研究提供很大的幫助。

附圖說明

下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的說明。