[發明專利]一種用于熒光PCR擴增試劑的凍干方法及其應用

有效

• 申請號: 201810792650.2
• 申請日: 2018-07-18
• 公開（公告）號: CN108913758B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 童超;陳智林;魏莎莎;高幼冷
• 申請（專利權）人: 貝南生物科技（廈門）有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供用于熒光PCR擴增試劑的凍干方法及其應用，熒光PCR擴增試劑包含熒光PCR擴增緩沖液、引物、探針、熱啟動Taq酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP及凍干保護劑。將熒光PCR擴增試劑各組分混合均勻，?35℃預凍3小時后，將凍干機氣壓降到10Pa以下?35℃真空處理2小時、10℃真空處理2小時、30℃真空處理2小時，即可得到熒光PCR擴增試劑凍干粉末。本發明將熒光PCR需要用到的所有組分制備在同一凍干粉末中，能夠實現常溫運輸及保存；使用時只需用凍干粉溶解液溶解該凍干粉，然后加入樣本即可。具有使用方便、穩定可靠的特點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于熒光PCR擴增試劑的凍干方法及其應用。

背景技術

熒光定量PCR技術是一種簡單快捷、高靈敏、特異的基因檢測方法，其反應的必要條件包括：熒光PCR反應緩沖系統、引物、探針、Taq酶、dNTP。

其中，熒光PCR反應緩沖系統組成成分通常為化學試劑、水，這一類試劑在儲存過程中較為穩定；引物、探針、dNTP為通過化學方法合成的試劑，需要低溫保存以避免其性狀發生變化從而影響使用效果；Taq酶為通過基因表達方法得到的一種活性蛋白，需要低溫保存以保持其活性；若將酶、dNTP、引物探針混合在一起保存，在液體狀態下引物探針會結合形成二聚體結構，從而影響擴增效果。

現階段，熒光定量PCR類產品的組成方式通常為：1管反應緩沖液+1管酶的形式。其中，反應緩沖液包含熒光PCR反應緩沖系統、引物、探針、dNTP；酶包含Taq酶、UNG酶。這種形式的產品使用方法復雜，必須先將反應緩沖液和酶按照比例混合均勻后，分裝至PCR擴增管中，然后再加入樣本。由于酶的用量通常較少（≤0.5μL）、酶液較粘稠，且配制過程繁瑣，配制誤差較大、反應重復性不好。而且試劑需要低溫（-20℃以下）保存，產品儲存及運輸的成本較高。

所以，為了滿足臨床需求，亟需發明一種使用方便、且不需要低溫保存及運輸的熒光PCR擴增試劑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于熒光PCR擴增試劑的凍干方法及其應用，該方法能夠實現熒光定量PCR所有組分混合在同一管中，產品無需低溫保存及運輸。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

(1)將熒光PCR擴增緩沖液、引物、探針、熱啟動Taq酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、凍干保護劑按照配方進行混合；

所述的凍干保護劑，包含：5wt.%的甘油、100mg/mL的海藻糖、5mmol/L的DTT、1wt.%牛血清白蛋白、0.3wt.%Proclin 300、1wt.%甲酰胺。

配方如下：

（2）將上述混合液按照50μL/管分裝到0.2mLPCR擴增管或者八聯管中。

（3）將分裝好的試劑放入凍干機中-35℃預凍3小時。

（4）將凍干機氣壓降到10Pa以下-35℃真空處理2小時。

（5）真空狀態下將凍干機內部溫度升至10℃真空處理2小時。

（6）真空狀態下將凍干機內部溫度升至30℃真空處理2小時。

分段式升溫真空處理，相較于傳統的固定溫度凍干方法，能夠顯著加快凍干過程、提高樣品的干燥度；在最后一段采用30℃干燥，使得樣品高于環境溫度，能夠保證無法在凍干機內部壓蓋的樣品，在凍干完成后取出來蓋蓋子的過程中不受環境濕度影響，延長凍干粉保存期，保證凍干的穩定性。

（7）凍干完畢后，蓋上擴增管或者八聯管蓋。

（8）制備好的熒光PCR凍干粉試劑常溫避光保存。