[發(fā)明專利]一種高效表達利拉魯肽前體的重組工程菌及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810787109.2
• 申請日: 2018-07-16
• 公開（公告）號: CN110724187B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設計）人: 楊柏成;趙運星
• 申請（專利權）人: 甘李藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C07K14/605
• 分類號: C07K14/605;C12N15/16;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發(fā)明提供了一種高效表達利拉魯肽前體的重組工程菌及其應用。本發(fā)明在利拉魯肽前體分子Arg34G LP?1(7?37)的N端設計信號肽和腸激酶酶切位點與之緊鄰，C端連接終止密碼子，三者構成目的基因，然后插入到表達載體兩個酶切位點之間，構建表達利拉魯肽前體的重組工程菌，將工程菌進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，以融合蛋白的包涵體形式表達，重組融合蛋白表達量高，重組融合蛋白約占菌體總蛋白的25％?35％，目的蛋白包涵體表達量達15?20g/L。包涵體雜蛋白含量低，利于分離純化，純化效率高，且穩(wěn)定性好，極大地降低了生產成本，提高了生產效率，在糖尿病治療藥物制備領域具有良好的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體地，涉及一種高效表達利拉魯肽的重組工程菌及其應用。

背景技術

近年來科學家們依據胰高血糖素樣肽1(GLP-1)具有促進胰島素分泌，調節(jié)血糖的生理機制，基于2型糖尿病患者具有GLP-1分泌缺陷，導致高血糖的病理機制，研制出GLP-1受體激動劑。GLP-1在治療2型糖尿病(T2DM)方面具有巨大的優(yōu)勢：①依賴人體血糖濃度升高情況調控機體血糖；②促進胰島β細胞增殖分化，抑制其凋亡，促進胰島素的分泌，提高機體胰島素敏感性；③抑制胃腸排空、增加飽腹感，減少進食、減輕體重。但唯一的不足是GLP-1在人體很容易被二肽基肽酶降解，它的體內半衰期只有短暫的幾分鐘，這就限制了的臨床運用，所以開發(fā)各種長效GLP-1類似物成為近20年的研究熱點，利拉魯肽則是具有這些特點的治療2型糖尿病的藥物。

利拉魯肽(liraglutide，商品名victoza)，是諾和諾德公司研發(fā)的一種每日皮下注射一次的酰胺化長效GLP-1類似物，在結構上，它是將GLP-1(7-37)的Lys34替換成Arg，并且在Lys26側鏈上連接一條16碳棕櫚脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)而得到的衍生物，與天然GLP-1有97％的同源性。在生產工藝方面，利拉魯肽目前是由諾和諾德公司利用釀酒酵母以胞外分泌方式表達利拉魯肽前體分子Arg34GLP-1(7-37)，并在其Lys26連接脂肪酸側鏈后切除多余氨基酸，獲得利拉魯肽分子，再進一步加工制備成注射液，并以進口藥形式在中國銷售，價格相當昂貴，多數患者難以承擔。

目前對于外源基因的表達可以采用原核表達和真核表達系統(tǒng)進行，但真核表達系統(tǒng)在表達目的蛋白時存在一些缺陷，例如：(1)利用酵母表達目的蛋白時會造成產物蛋白的不均一降解、信號肽加工不完全、多聚體形成等問題。而且，釀酒酵母表達蛋白時會出現蛋白切割問題、蛋白分泌效率低等問題。(2)昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)也存在著一定的缺陷。例如，隨著感染宿主的多角體病毒的死亡，異源蛋白不能連續(xù)表達。每一輪新蛋白的合成都需要重新感染宿主細胞。此外，雖然桿狀病毒表達系統(tǒng)能夠對目的蛋白做翻譯后修飾，但這種修飾存在著一定的限度；雖然其糖基化位點與在哺乳動物細胞中一樣，但寡糖鏈的性質有所不同，無法產生復雜的糖基側鏈，這可能是由于昆蟲細胞不能將成熟糖鏈加工成哺乳動物細胞中類似的形式。(3)哺乳動物表達系統(tǒng)在表達外源基因時存在成本相對較高，技術復雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染等。

原核表達系統(tǒng)方面，大腸桿菌表達系統(tǒng)是研究最為深入，發(fā)展最迅速的表達系統(tǒng)，其遺傳學背景、基因表達調控機理清晰，表達載體及宿主菌種類繁多，常被用于多肽和蛋白質的表達，是目前首選的外源表達系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)由表達載體、外源基因和宿主菌組成，表達載體是其中的核心部分，其普遍的共性是：重組質粒拷貝數高，表達量高；適用范圍廣；表達產物容易純化；在菌體內穩(wěn)定性好。目前已知并應用較廣的大腸桿菌表達載體主要分為非融合表達載體、融合表達載體、分泌型表達載體和表面呈現表達載體等，很大程度地改善了重組外源蛋白表達量不高以及下游分離加工難度大等問題。其中融合蛋白表達技術的表達模式是：原核啟動子→SD序列→起始密碼子→原核結構基因片斷→目的基因序列→終止密碼子，是比較常用的表達載體，尤其適用于小分子多肽和蛋白的表達，并能顯著提高重組蛋白的表達成功率及表達量。