[發明專利]一種免疫原性多糖疫苗及其鑒別方法

在審

• 申請號: 201810784491.1
• 申請日: 2018-07-17
• 公開（公告）號: CN109010813A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 王倩;羅麗娜;蘇玉婷;鐘正丹;王超;李銀波;敬小兵;劉思利;張建軍;凌燕;楊冬妮;黃放;王巖;薛平
• 申請（專利權）人: 成都安特金生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/095
• 分類號: A61K39/095;A61K39/102;A61K39/02;A61K39/085;A61K39/00;A61K39/09;A61K39/106;A61K39/08;A61P31/04;A61P31/10;G01N33/557;G01N33/558;G01N21/82
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 陳常美

本發明涉及一種免疫原性多糖及其鑒別方法以及根據上述免疫原性多糖制備的多糖疫苗及其鑒別方法。免疫速率散射比濁至少包括將多糖抗原與相應抗體接觸形成抗原抗體復合物，再經免疫速率散射比濁測定生成抗原抗體復合物的反應速率值。本發明的速率散射比濁法是一種基于免疫化學方法建立的技術手段，速率散射比濁法可測量懸浮于小杯中的顆粒所造成的散射光強度變化，可在幾十秒內得出反應速率值?？乖贵w反應形成抗原抗體復合物聚集體顆粒，抗原或抗體濃度的不同形成顆粒的速率不同。該法特異性強，靈敏度高，節約檢測時間，且抗原抗體直接接觸，有利于低濃度樣品檢測，可用于疫苗生產過程中原液和/或半成品和/或成品的鑒別。

技術領域

本發明涉及醫療領域，具體的涉及疫苗及疫苗的鑒別，尤其是一種免疫原性多糖及其鑒別方法以及一種免疫原性多糖疫苗及其鑒別方法。

背景技術

細菌中存在的多糖物質，在細菌的識別、信號傳遞、黏附、感染及防御等方面發揮著重要作用，通過提取純化細菌中引起特異性保護作用的多糖抗原，可生產具有特異性的多糖疫苗。接種多糖疫苗可預防多種疾病感染，控制好多糖疫苗質量尤其重要，只有疫苗被鑒別無誤、組分正確后，才有必要進行檢查和含量測定等分析工作。尤其在疫苗中存在多種抗原時，鑒別試驗在檢測疫苗的質量穩定性，疫苗組分的正確性過程中起到了至關重要的作用。除此之外，利用特異性免疫反應對疫苗進行鑒別試驗，還可以間接證明疫苗中各有效成分是否具有相應的抗原性，疫苗制備的工藝過程是否會破壞各成分的抗原性。

鑒別試驗作為判斷疫苗真偽，明確疫苗組分等的有效手段，在疫苗的質量檢驗工作中當屬首項。歐洲藥典《European Pharmacopoeia 8.0》、WHO規程《WHO TechnicalReport Series》、《中華人民共和國藥典》(2015年版三部)均要求對疫苗原液和成品進行鑒別?！禘uropean Pharmacopoeia 8.0》中推薦多糖疫苗如：腦膜炎球菌多糖疫苗、傷寒多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗用免疫學方法和核磁共振技術進行鑒別試驗，《WHO TechnicalReport Series》推薦多糖疫苗如：腦膜炎球菌多糖疫苗用免疫學方法和核磁共振技術進行鑒別試驗，《中華人民共和國藥典》(2015版三部)中收載的多糖疫苗制品如：傷寒Vi多糖疫苗、A群腦膜炎球菌多糖疫苗、A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群腦膜炎球菌多糖疫苗推薦鑒別方法為免疫雙擴散法。該法是在瓊脂板上打孔，抗原抗體加入相應孔中，待其自由擴散后，抗原抗體形成可見的沉淀線。其中抗原抗體自由擴散的速度受分子量影響，分子量小者，擴散快，反之較慢。自由擴散這一性質使得該法耗時長，且對于分子量較大的樣品沉淀線不明顯。

《中華人民共和國藥典》(2015年版3部)中收載的多糖疫苗采用免疫學鑒別方法(免疫雙擴散法)，該法具體操作是：取瓊脂糖加生理鹽水煮沸溶脹成1.5％溶液，趁熱傾倒于水平玻板上(每平方厘米加0.19ml瓊脂糖)，凝固后，在玻板上打方陣型孔(直徑3mm，孔距3mm)。根據需要確定方陣型圖數量。中央孔加入抗血清，周邊孔加入供試品溶液，并留1孔加入相應陽性對照血清，每孔加樣20μl，然后置水平濕盒中，37℃水平擴散24h。用生理氯化鈉溶液充分浸泡瓊脂糖凝膠板，將浸泡好的瓊脂糖凝膠板放入0.5％氨基黑溶液中染色。用脫色液脫至背景無色，沉淀線呈清晰藍色為止。用適當方法保存或復制圖譜。該法中抗原抗體濃度不宜過小，自由擴散過程的稀釋，導致濃度太小無法產生沉淀線，樣品分子量過大也不利于擴散，影響試驗效果。

具體操作時，免疫雙擴散法需預先制備凝膠板，將抗原抗體稀釋至合適濃度，分別加入相應孔中，37℃水平擴散24h，再浸泡30min，染色30min，再經脫色液脫至背景無色，觀察，整個過程耗時2天左右甚至更長，且采用自由擴散的方式使抗原抗體接觸，樣品分子量不宜過大，濃度不宜過低，否則均較難形成清晰的沉淀線，尤其對于在制備過程中因一系列反應使抗原性降低的樣品，更難以達到免疫雙擴散法中需求的適宜的抗原濃度，從而導致鑒別試驗實施困難。

發明內容