[發(fā)明專利]一種微量RNA的提取方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810782364.8 | 申請日： | 2018-07-17 |
| 公開（公告）號： | CN108866042B | 公開（公告）日： | 2021-02-09 |
| 發(fā)明（設計）人： | 陳欣欣;葉國棟;許劍雄;陳茂立;韓大雄;郭奇?zhèn)?/a>;肖劍萍;蔡逸民;楊燕燕;李順杰;董康梅;朱莎莎;張麗芳;宋丹 | 申請（專利權(quán)）人： | 廈門生命互聯(lián)科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 廈門市精誠新創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35218 | 代理人： | 秦華 |
| 地址： | 361000 福建省廈門市海滄區(qū)翁*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 微量 rna 提取 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種微量RNA的提取方法。步驟:樣本裂解：使血小板完全裂解并釋放出RNA；RNA分離：采用核酸輔助沉淀劑結(jié)合磁珠法實現(xiàn)從樣本中分離RNA；其中核酸輔助沉淀劑為糖原；RNA純化：去除非特異性結(jié)合于磁珠的DNA和蛋白質(zhì)雜質(zhì)。本發(fā)明提供了一種適用于血小板的微量RNA提取方法，目的在于從低至1×105個血小板或10個細胞中分離到高質(zhì)量且足量的RNA，以供下游實驗和分析。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及一種微量RNA的提取方法。
背景技術(shù)
RNA提取是進行以RNA研究為主的分子生物學研究的基礎，是研究基因表達的關(guān)鍵步驟。血小板RNA檢測作為一種新型液體活檢技術(shù)，在癌癥篩查與心血管疾病的研究和監(jiān)控中有著極為重要的應用前景。1×105個血小板中總RNA含量約為100pg，其質(zhì)量僅相當于10個白細胞的RNA。如何從起始量極少的樣本中提取高質(zhì)量的RNA應用于下游實驗，是亟待解決的課題。
傳統(tǒng)的酚氯仿法和CTAB法等RNA提取方法，所需樣本的初始量大，需要大于1×105個細胞或5mg組織，無法進行微量樣本RNA的提取。現(xiàn)有的吸附柱法采用硅膠膜技術(shù)，對樣本的起始量亦有較嚴格的要求，且在洗脫過程中無法完全釋放RNA，對RNA造成較大的損耗，使得得率降低。
傳統(tǒng)方法采用醇沉方式沉淀RNA，然而在較大的體積中，微量RNA樣本難以沉淀；并且已沉淀的微量樣本由于肉眼不可見，很容易在后續(xù)的洗滌過程中損失。并且在采取去污劑裂解細胞的RNA提取方法中，去污劑(如CTAB、SDS等)的殘留將極大影響后續(xù)反應。現(xiàn)有的柱提法與磁珠法大多數(shù)也只適用于大量RNA的提取，對于極微量RNA的提取也有洗脫體積的限制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有RNA提取技術(shù)的不足之處，提供一種適用于血小板的低起始量、高得率、高質(zhì)量且安全的RNA提取方案，同時也適用于從痕量細胞中提取RNA。分離純化后的RNA可直接用于后續(xù)實驗，如實時熒光定量PCR和RNA測序等。目的在于從低至1×105個血小板或10個細胞中分離到高質(zhì)量且足量的RNA，以供下游實驗和分析。本發(fā)明主要針對傳統(tǒng)RNA提取方法存在的起始量大、RNA得率低、雜質(zhì)多、無法提取微量樣本RNA等問題做出了改進，從痕量樣本中所分離的RNA得率高、完整性好，符合下游實驗的需求。洗脫體積小，也可在不經(jīng)分離磁珠與核酸的條件下進行逆轉(zhuǎn)錄等下游實驗。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種微量RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步驟:
樣本裂解：使血小板完全裂解并釋放出RNA；
RNA分離：采用核酸輔助沉淀劑結(jié)合磁珠法實現(xiàn)從樣本中分離RNA；其中核酸輔助沉淀劑為糖原；
RNA純化：去除非特異性結(jié)合于磁珠的DNA和蛋白質(zhì)雜質(zhì)。
進一步，所述RNA純化步驟后，還包括RNA洗脫步驟；優(yōu)選的，所述RNA洗脫步驟為采用含核酸保護劑的洗脫液進行洗脫獲得穩(wěn)定的RNA溶液。
進一步，所述樣本裂解為，取樣本，加入裂解液，渦旋混勻，室溫靜置。
進一步，所述樣本的體積量可低至10個細胞，或1×105個血小板。
進一步，所述裂解液含異硫氰酸胍和糖原；優(yōu)選的，裂解液配方為：5M異硫氰酸胍，20mM EDTA，10mM Tris-HCl pH6.4，0.1％20mg/mL糖原；
任選的，當樣本為一定體積的樣本時，所述樣本與裂解液L的體積比例為1:(3～5)；優(yōu)選的，樣本與裂解液L的體積比例為1:4。
進一步，所述RNA分離為，用緩沖液沉淀RNA，并使其吸附于磁珠B，其中緩沖液含有異丙醇和LiCl；優(yōu)選的，緩沖液的配方為2M LiCl，80W/V％異丙醇。
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