[發(fā)明專利]人體尿液中雌激素及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810781382.4
• 申請(qǐng)日: 2018-07-17
• 公開（公告）號(hào): CN109100436A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔智剛;朱文漓;葉尚宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都益康譜科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
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• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供了一種人體尿液中雌激素及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法，涉及雌激素及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該檢測(cè)方法將人體尿液與內(nèi)標(biāo)液混合，隨后對(duì)其依次進(jìn)行酶水解、有機(jī)溶劑萃取、反相介質(zhì)固相萃取純化和目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)衍生。保證了尿液中雌激素及其代謝產(chǎn)物的充分溶出，排除尿液中雜質(zhì)的干擾，確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。隨后，采用液相色譜分離與質(zhì)譜離子對(duì)檢測(cè)聯(lián)用的方法對(duì)雌激素及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行同步定性和定量分析。該方法適用于人體尿液中結(jié)構(gòu)類似、化學(xué)物理性質(zhì)接近的雌激素及其代謝產(chǎn)物的同步批量檢測(cè)，具有靈敏度高、精密度高、重復(fù)性好、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。充分滿足了臨床檢驗(yàn)的需要，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及雌激素代謝產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種人體尿液中雌激素代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

雌激素是脊椎動(dòng)物中存在的一類重要的性激素，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和系統(tǒng)的功能維持有著及其重要的作用。在生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的角色。

雌激素是一類脂溶性的類固醇小分子化合物，有游離態(tài)和結(jié)合物這倆種形態(tài)。其中在機(jī)體內(nèi)主要是以結(jié)合態(tài)存在，在血中70%與性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）結(jié)合，25%與白蛋白結(jié)合，5%保持游離狀態(tài)。其中，結(jié)合態(tài)的雌激素不具有生理活性，而游離態(tài)的雌激素可以自由透過(guò)靶細(xì)胞內(nèi)并與相應(yīng)的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)功能蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

膽固醇是所有類固醇激素的前體，而雌二醇β-Estradiol (E2)是體內(nèi)最常見的內(nèi)源性雌激素，可以與受體結(jié)合參與調(diào)控基因表達(dá)，促進(jìn)人體的生長(zhǎng)。雌酮Estrone (E1)是卵巢分泌合成雌二醇的前體物質(zhì)，在酶的催化下可以轉(zhuǎn)化為雌二醇。該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，雌二醇也可被還原為雌酮。雌三醇Estriol(E3)是E1和E2的外周組織代謝物，活性較低，被認(rèn)為是具有解毒功能的一種雌激素。

雌激素在體內(nèi)主要經(jīng)過(guò)兒茶酚代謝途徑發(fā)生代謝反應(yīng)，主要是雌酮或雌二醇發(fā)生氧化代謝（羥基化反應(yīng)）與結(jié)合代謝（O-甲基化，葡萄糖醛酸化及磺化反應(yīng)等）。在細(xì)胞色素酶P450的催化下， E1和E2的C-2，C-4和C-16位點(diǎn)發(fā)生羥基化反應(yīng)，產(chǎn)生A環(huán)代謝物2-OHE1，2-OHE2，4-OHE1，4-OHE2和D環(huán)代謝物16α-OHE1。其中，2-OHE1，2-OH E2，4-OHE1，4-OHE2可以在P450和過(guò)氧化酶的作用下再進(jìn)一步形成氧化產(chǎn)物醌類物質(zhì)。在此轉(zhuǎn)變過(guò)程中產(chǎn)生一系列的活性氧自由基，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，通過(guò)不斷的氧化代謝循環(huán)使其成為羥基化雌激素代謝的協(xié)同因子，再與DNA加合導(dǎo)致DNA的氧化損傷。醌類物質(zhì)同時(shí)還可以與乳腺細(xì)胞中引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和非正常細(xì)胞繁殖的致癌基因和抑癌基因的DNA反應(yīng)形成去嘌呤加合物等毒性代謝物，并且產(chǎn)生脫嘌呤核苷位點(diǎn)，從而引起體內(nèi)堿基的丟失和致癌性DNA突變。4-OHE1在體內(nèi)的半衰期相比2-OHE1更長(zhǎng)，更容易被氧化成醌類物質(zhì)，與DNA結(jié)合并增加DNA復(fù)制的錯(cuò)誤機(jī)會(huì)，在乳腺癌患者中變化更明顯，從而增加了乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，E1和E2的羥基化代謝物是致癌性的分子標(biāo)志物。

雌激素甲基化反應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)雌激素致癌效應(yīng)起到防御作用的主要途徑。2-OHE1，4-OHE1可以在兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶等作用下脫離形成醌類物質(zhì)的代謝途徑，形成甲基化產(chǎn)物，迅速失活并形成可溶于水的代謝產(chǎn)物隨尿液排出體外。兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的部分甲基化雌激素代謝物如2-MeOE2被認(rèn)為具有解毒作用甚至具有抑癌作用，其與激素受體ER和ER的結(jié)合力均很低，因此雌激素活性也很弱。可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和上皮細(xì)胞的血管生長(zhǎng)和直接抑制腫瘤細(xì)胞的增值起到抑癌的作用。

許多研究表明，乳腺癌是一種與患者體內(nèi)雌激素密切相關(guān)的腫瘤，與雌激素的水平及其代謝異常顯著相關(guān)。一旦內(nèi)分泌失衡、代謝紊亂就容易造成乳腺增生并導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。在分子水平上，雌激素代謝途徑基因的多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生關(guān)系的流行病學(xué)也表明激素代謝物與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。