[發(fā)明專利]一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測奶粉中志賀氏菌的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810778035.6
• 申請日: 2018-07-16
• 公開（公告）號: CN108866163A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳冰;邱霞;蕭綺倩;張任廣;鄭傳發(fā);吉宇恒
• 申請（專利權(quán)）人: 中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 羅毅萍

本發(fā)明公開了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其包括以下步驟：S1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)引物的設(shè)計(jì)與合成；S2、DNA模板的制備：制備志賀氏菌菌液，人工污染脫脂奶粉樣品，采用熱裂解法提取細(xì)菌基因組；S3、樣品的LAMP檢測：取DNA模板分別加入內(nèi)引物FIP/BIP、外引物F3/B3、環(huán)引物L(fēng)F/LB在LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，最后分別取擴(kuò)增產(chǎn)物通過直接目測法或瓊脂糖凝膠電泳法，判斷結(jié)果。對于本發(fā)明，不僅操作簡單、檢測速度快，而且靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，檢出限達(dá)到1.0×10¹CFU/mL，檢測準(zhǔn)確度為99.09％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測奶粉中志賀氏菌的方法。

背景技術(shù)

志賀氏菌為兼性厭氧型革蘭氏陰性菌，可通過消化道傳播并引發(fā)機(jī)體急性感染性痢疾，因此也被稱作為痢疾桿菌。志賀氏菌附著力、侵襲力強(qiáng)，其進(jìn)入機(jī)體后能分泌大量的內(nèi)、外毒素，造成腹痛、腹瀉、局部粘膜炎癥甚至潰瘍、壞死等病癥，尤其對嬰幼兒具有致命性危害。流行病顯示，感染性痢疾多發(fā)于6-9月，主要為患病者進(jìn)食被志賀氏菌污染的食物所致，具有感染率高、致病率高等特點(diǎn)。志賀氏菌通過食品感染人類，在奶制品、水產(chǎn)品、雞肉、水果、面包等食品中經(jīng)常被檢出。發(fā)病時(shí)若不及時(shí)救助，會危及生命。因此，志賀氏菌是食品安全領(lǐng)域的重點(diǎn)監(jiān)測對象，建立并應(yīng)用快速、準(zhǔn)確的志賀氏菌檢測方法具有重要意義。

目前，對志賀氏菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的分離鑒定方法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。然而，傳統(tǒng)的志賀氏菌檢測方法是根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.4-2016)進(jìn)行的，其步驟比較繁瑣，耗時(shí)較長，至少需要4-7天才能得出明確的診斷結(jié)果，雖然此方法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但已不能滿足實(shí)際工作的需要；免疫學(xué)方法主要利用抗原-抗體之間的特異性反應(yīng)，是一種定性或定量的診斷技術(shù)，其靈敏性和特異性比較高，但其操作復(fù)雜、試驗(yàn)條件要求高等因素，在臨床應(yīng)用上帶來了較大的不便；分子生物學(xué)方面需要昂貴的儀器設(shè)備，且受人為操作技術(shù)的影響較大，不能區(qū)別核酸來源于死細(xì)胞還是活細(xì)胞，在基層單位也很難普及和推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其不僅操作簡單、檢測速度快，而且靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。

為了解決上述問題，本發(fā)明按以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測奶粉中志賀氏菌的方法，包括以下步驟：

S1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)引物的設(shè)計(jì)與合成：

根據(jù)志賀氏菌ipaH基因(GenBank登錄號：HE616529.1)，并用生物學(xué)在線軟件分析該基因的保守核苷酸序列，針對ipaH基因的保守區(qū)域，結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Explorer V4在線引物設(shè)計(jì)軟件篩選并合成LAMP引物：內(nèi)引物FIP/BIP、外引物F3/B3、環(huán)引物L(fēng)F/LB；

S2、DNA模板的制備：

制備志賀氏菌菌液，人工污染脫脂奶粉樣品，將污染樣品梯度稀釋，采用熱裂解法提取細(xì)菌基因組，得到不同濃度的DNA模板溶液；

S3、樣品的LAMP檢測：

取步驟S2所得不同濃度的DNA模板分別加入步驟S1所得內(nèi)引物FIP/BIP、外引物F3/B3、環(huán)引物L(fēng)F/LB在LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，分別取擴(kuò)增產(chǎn)物通過直接目測法或瓊脂糖凝膠電泳法，判斷結(jié)果。