[發明專利]一種環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法

在審

• 申請號: 201810778035.6
• 申請日: 2018-07-16
• 公開（公告）號: CN108866163A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 吳冰;邱霞;蕭綺倩;張任廣;鄭傳發;吉宇恒
• 申請（專利權）人: 中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 羅毅萍

1.一種環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、環介導等溫擴增技術(LAMP)引物的設計與合成：

根據志賀氏菌ipaH基因(GenBank登錄號：HE616529.1)，并用生物學在線軟件分析該基因的保守核苷酸序列，針對ipaH基因的保守區域，結合環介導等溫擴增方法的引物設計原則，利用Primer Explorer V4在線引物設計軟件篩選并合成LAMP引物：內引物FIP/BIP、外引物F3/B3、環引物LF/LB；

S2、DNA模板的制備：

制備志賀氏菌菌液，人工污染脫脂奶粉樣品，將污染樣品梯度稀釋，采用熱裂解法提取細菌基因組，得到不同濃度的DNA模板溶液；

S3、樣品的LAMP檢測：

取步驟S2所得不同濃度的DNA模板分別加入步驟S1所得內引物FIP/BIP、外引物F3/B3、環引物LF/LB在LAMP反應體系及反應條件下進行擴增，分別取擴增產物通過直接目測法或瓊脂糖凝膠電泳法，判斷結果。

2.根據權利要求1所述的環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其特征在于，步驟S1所得LAMP引物包括：內引物FIP為TCCGCGACACGTTCCCTCTATTGTCAGTACGCTTCGCC，內引物BIP為TGCCGATTTGAAGGCCGGTACACCGTGGTCCGTTCTGAA，外引物F3為ACTCTCCCAGTGTGCTTTGAT，外引物B3為CTTTTCGTGAAAAATTGAAA，環引物LF為TGGCATGCTTTGAACAGATAA，環引物LB為TATTGAGTTCGTTCTAATCAACT。

3.根據權利要求1所述的環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其特征在于，步驟S2包括：將志賀氏菌接種于R&F志賀氏菌屬顯色培養基，37℃培養16-24h，再挑取單菌落于LB培養液中，37℃、200r/min條件下，振蕩培養16-48h，得到所述志賀氏菌菌液。

4.根據權利要求3所述的環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其特征在于，步驟S2包括：將所得志賀氏菌菌液接種到脫脂奶粉樣品中，10倍梯度稀釋所述污染樣品，使所述污染樣品中志賀氏菌的濃度依次為10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸CFU/mL，再分別取1.0mL所述污染樣品，10000-12000r/min離心2-5min，滅菌蒸餾水洗滌兩次，再用300μL TE緩沖液懸浮，隔水煮沸10-20min，8000-10000r/min離心10-20min，取上清液，得到不同濃度的所述DNA模板溶液。

5.根據權利要求1所述的環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其特征在于，步驟S3包括：所述LAMP反應體系(25μL)為：2.5μL 10×ThermoPol緩沖液，1.5μL MgSO₄，3μL引物，3.5μL dNTPs，2.5μL甜菜堿，1μL Bst 2.0DNA聚合酶，2μL DNA模板，1μL鈣黃綠素，8μL ddH2O。

6.根據權利要求5所述的環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其特征在于：3μL所述引物包括1μL的20μmol/L內引物FIP/BIP、1μL的10μmol/L外引物F3/B3、1μL的15μmol/L環引物LF/LB。

7.根據權利要求5所述的環介導等溫擴增技術檢測奶粉中志賀氏菌的方法，其特征在于，步驟S3包括：所述LAMP反應條件為：將配備好的所述LAMP反應體系于60-65℃恒溫水浴擴增30-60min，再75-85℃使所述Bst 2.0DNA聚合酶失活。