[發明專利]一種基于重組核受體蛋白的生物效應物質高通量篩查鑒定方法

有效

• 申請號: 201810775059.6
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN109085361B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 胡建英;張虹;賈映亭;胡文欣;張照斌
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N30/02
• 代理公司: 北京君尚知識產權代理有限公司 11200
• 代理人: 余長江

本發明涉及一種基于重組核受體蛋白的生物效應物質高通量篩查鑒定方法。利用帶標簽的選定重組核受體蛋白選擇性地吸附到磁珠載體上，再根據核受體與小分子親和結合的原理，利用重組核受體蛋白特異性地從復雜環境介質中捕獲具有結合活性的效應物質，再結合超高效液相色譜?四級桿靜電場軌道阱高分辨質譜技術進行高通量、非靶向效應物質的分析。本發明提高了物質鑒定的特異性和效率，能夠應用于環境中與核受體結合的效應物質的快速篩選和結構鑒定，也可以用于藥物開發。

技術領域

本發明屬于生物化學檢測領域，涉及一種篩查與重組核受體蛋白特異性結合的生物效應物質的方法，特別涉及一種重組核受體蛋白固定于鎳磁珠上的親和結合篩選方法及其基礎上建立的高通量非靶向效應物質鑒定方法。

背景技術

全球化學品正在以爆炸性的速度增長，迄今為止美國化學文摘社登記了超過1.087億個商用化學品，這些物質在給人們生活帶來便利的同時也以各種形式進入環境介質，如室內灰塵，飲用水等。大量研究表明環境中一些化學物質會干擾內分泌系統，從而影響生態與人類健康，但是對于導致這些問題的特定的效應物質，知之甚少。

鑒定復雜環境介質中有毒的化合物組成主要障礙在于環境基質的復雜性，目前環境中生物效應物質的鑒定主要是利用效應導向的化學物質鑒定方法(Effects directedanalysis,EDA，可參見Brack W.Effect-directed analysis:a promising tool for theidentification of organic toxicants in complex mixtures.Anal BioanalChem.2003.377(3):397-407.)。但是該方法耗時耗力，需要采用氣相或液相色譜進行多步餾分分割實驗，化學分析和生物活性測試相互獨立，特異性差，選擇性低，因此復雜環境基質中痕量生物效應物質鑒定的成效非常低下。

發明內容

為了從環境樣品中特異性地高通量篩選和鑒定生物效應物質的目的，本發明提供了一種基于核受體蛋白與小分子親和結合原理的生物效應物質的高通量鑒定方法。

本發明采取的技術方案為：

一種基于重組核受體蛋白的生物效應物質篩查鑒定方法，包括：

將帶標簽的選定重組核受體蛋白與待測環境介質混合，使上述重組核受體蛋白結合環境介質中的生物效應物質；

將結合生物效應物質的重組核受體蛋白固定到磁珠載體上；

洗脫得到核受體蛋白與生物效應物質的混合物；

對混合物進行液液萃取得到樣品；

采用不表達上述重組核受體蛋白的空載體蛋白，基于上述同樣過程得到對照；

篩選樣品與對照之間的差異化合物；

通過化學數據庫和質譜數據庫搜索以鑒定上述差異化合物。

進一步地，本發明通過對樣品和對照進行高分辨液相色譜質譜檢測，采用Progenesis QI軟件對采集到的數據進行設定的預處理，再采用Simca-P軟件對預處理后的數據進行多元統計方法分析，篩選出兩者之間的差異化合物。

進一步地，上述多元統計方法包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Projections to Latent StructuresDiscriminant Analysis，OPLS-DA)，根據變量重要性因子VIP、非參數T檢驗、樣品組與對照組峰面積倍數關系(fold change)(樣品組是重組核受體蛋白結合效應物質和非特異性物質，對照組是空載體蛋白結合非特異性物質)來篩選上述差異化合物。