[發明專利]一種RT-RPA-側流層析雙重檢測戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201810769903.4
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN108841926B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 高慎陽;李丹丹;查恩輝;張體銀;周鐵忠;岳喜慶
• 申請（專利權）人: 錦州醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70;C12N15/11
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 侯蔚寰

本發明公開了一種用于雙重檢測甲型肝炎病毒與戊型肝炎病毒的RT?RPA?側流層析試劑盒，包括：應用于RT?RAP擴增技術戊型肝炎病毒ORF2基因序列的上游引物、中間探針與下游引物和/或甲型肝炎病毒VP1基因序列的上游引物、中間探針與下游引物，重組酶聚合酶擴增技術所需常規試劑以及測流層析試紙條，所述測流層析試紙條包括加樣墊、對照線、1號檢測線和/或2號檢測線，通過對照線、檢測線與引物及探針標記的配合，使用該試劑盒能夠快速、靈敏、特異地、在非實驗室環境下也可以現場檢測檢測樣本中戊型肝炎病毒ORF2基因和/或甲型肝炎病毒VP1基因。

技術領域

本發明屬于生物核酸分子檢測技術領域，具體涉及一種應用反轉錄后重組酶依賴擴增技術檢測方法(Reverse Transcript RecombinasePloymerase Amplification,RT-RPA)與測流層析試紙條檢測方法相結合的實現戊型肝炎病毒與甲型肝炎病毒雙重檢測的方法及試劑盒。

背景技術

我國是肝病負擔大國，甲肝與戊肝是除乙肝之外發病率最高的兩種經消化道路傳播的兩種重要疾病。根據臨床和流行病學觀察，甲型肝炎病毒(HAV)多侵犯兒童及青年。發病率隨年齡增長而遞減。臨床表現多從發熱、疲乏和食欲不震開始，繼而出現肝腫大、壓痛、肝功能損害，部份患者可出現黃疸。戊型肝炎病毒(HAV)多侵犯二十歲以上的青壯年人，引起的肝炎在臨床癥狀上與HAV十分相似，但多以急性暴發為主，尤其維產期的感染孕婦病死率高達40％以上。HAV和HEV均能隨患者糞便排出體外，通過污染水源、食物、海產品(如毛蚶等)、食具等的傳播可造成散發性流行或大流行，也可通過輸血或注射方式傳播。尤其HEV呈人畜共患性，全球分布。人與豬源HEV核酸同源性最高可達99％以上。因此HAV和HEV被WHO將列為是發展中國家的重要公共衛生問題。

目前關于甲、戊型肝炎檢測多采用測ELISA捕捉IgM抗體法檢測和膠體金免疫層析技術(GICA)檢測，但由于ELISA操作程序較為復雜，時間長，給實驗室帶來諸多不便，后期提出的ELISA一步法，雖然簡化了操作程序，縮短了檢測時間，但卻帶來了個別強陽性標本將陽性問題，膠體金免疫層析技術(GICA)存在膠體金的穩定性不好把控，弱陽性標本所需時間較長等問題，而且上述方法檢測成本高且操作不便，不利于現場快速檢測應用。因此，亟待開發一種快速、高靈敏度和特異性、可用于臨床現場檢測的可靠新方法。

重組酶聚合酶擴增技術(RPA)，是由英國TwistDx Inc公司開發出來的一種不同于PCR的核酸檢測技術，它是一種新的核酸分子快速恒溫擴增技術，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。該技術主要包括：在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈。反應產物也是以指數級增長，通常在1小時內即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段。另外，在RPA擴增體系中加入一個FAM或DIG分子標記的反向引物和5’生物素標記的探針，且探針標記的熒光基團約30個堿基處修飾一個脫堿基位點(dSpacer)或THF，該位點是DNA修復酶作用的底物，可被核酶NFO識別切割，產生新的3’羥基末端，進而在DNA聚合酶的作用下繼續進行復制延伸，從而使雙標信號與擴增產物的累積同步，檢測結果可特異性地被抗生物素金標結合和抗分子標記捕獲抗體的膠體金(GICA)或膠體碳(CCICA)的側流層析試紙條上顯示。整個反應簡單快速，因為不需要高溫循環，所以特別適合在有大量樣品的非實驗室檢測場所使用。但是，目前國內外還沒有將RPA技術應用于HAV或HEV檢測的報道。

發明內容