[發明專利]一種RT-RPA-側流層析雙重檢測戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201810769903.4
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN108841926B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 高慎陽;李丹丹;查恩輝;張體銀;周鐵忠;岳喜慶
• 申請（專利權）人: 錦州醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70;C12N15/11
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 侯蔚寰

1.一種RT-RPA-側流層析雙重檢測戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的引物對和探針組合，其特征在于，具體為檢測戊型肝炎病毒ORF2 基因和甲型肝炎病毒VP1 基因的引物對和探針，其中戊型肝炎病毒ORF2 基因的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探針序列如SEQIDNo.3 所示和SEQIDNo.4所示；甲型肝炎病毒VP1 基因的正向引物序列如SEQIDNo.5 所示，反向引物序列如SEQIDNo.6 所示，探針序列如SEQIDNo.7 所示和SEQIDNo.8 所示；

所述戊型肝炎病毒ORF2 基因的探針，其SEQIDNo.3 所示序列5’端連接有第一標記分子，SEQIDNo.4所示序列3’端連接有防止聚合反應的保護標簽，SEQIDNo.3 所示序列3’端和SEQIDNo.4所示序列5’端由能夠被具有DNA 損傷修復活性的酶識別并切除的人工堿基類似物連接；

所述甲型肝炎病毒VP1 基因的探針，其SEQIDNo.7所示序列5’端連接有第一標記分子，SEQIDNo.8所示序列3’端連接有防止聚合反應的保護標簽，SEQIDNo.7 所示序列3’端和SEQIDNo.8所示序列5’端由能夠被具有DNA 損傷修復活性的酶識別并切除的人工堿基類似物連接；

所述戊型肝炎病毒ORF2 基因的反向引物5’端連接有第二標記分子；

所述甲型肝炎病毒VP1 基因的反向引物5’端連接有第三標記分子；

所述戊型肝炎病毒ORF2 基因的探針和正向引物處于同一擴增方向；所述甲型肝炎病毒VP1 基因的探針和正向引物處于同一擴增方向；

所述探針中，防止聚合反應的保護標簽為C3-spacer；能夠被具有DNA 損傷修復活性的酶識別并切除的所述人工堿基類似物為四氫呋喃（THF）；

所述第一標記分子為生物素（Biotin），第二標記分子為熒光分子FAM，第三標記分子為地高辛（Dig）。

2.一種RT-RPA-側流層析雙重檢測戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述檢測戊型肝炎病毒ORF2 基因和甲型肝炎病毒VP1 基因的引物對和探針組合。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括測流層析試紙條，所述測流層析試紙條包括加樣墊、對照線、1 號檢測線和/或2 號檢測線。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述加樣墊含有膠體碳顆粒標記的所述第一標記分子特異結合物；所述對照線包被有第一標記分子的特異結合物；所述1 號檢測線包被有第二標記分子特異結合物；所述2 號檢測線包被有第三標記分子特異結合物；

所述第一標記分子特異結合物為鏈霉親和素；所述第二標記分子特異結合物為抗FAM

抗體；所述第三標記分子特異結合物為地高辛抗體。

5.一種非診斷治療目的的RT-RPA-側流層析雙重檢測戊型肝炎病毒和甲型肝炎病毒的方法，其特征在于， 所述方法包括如下步驟：

（1）將待測樣本中提取的總RNA進行反轉錄，獲得cDNA；利用權利要求1所述的戊型肝炎病毒ORF2 基因的引物及探針和甲型肝炎病毒VP1 基因的引物及探針對所得的cDNA進行RPA 擴增；

（2）使用測流層析試紙條檢測擴增產物，判定樣本中是否含有戊型肝炎病毒和/或甲型肝炎病毒；

判定方法：10 分鐘內，（1）當對照C 線出現證明實驗有效，此時1、2檢測線同時出現，說明同時存在HEV 和HAV，檢出判定均為陽性結果；（2）當對照C 線出現證明實驗有效，此時僅1 號檢測線出現而2號不出現，說明有HEV 檢出判定為陽性結果，而HAV 檢出判定為陰性結果；（3）當對照C 線出現證明實驗有效，此時僅2 號檢測線出現而1 號不出現，說明有HAV檢出判定為陽性結果，而HEV 檢出判定為陰性結果；（4）當對照C 線出現證明實驗有效，此時1、2 檢測線均不出現，說明HEV 和HAV 均未檢出判定為全部陰性結果；（5）當對照C 線不出現時，說明實驗無效，檢測結果無意義。