[發明專利]兩步基因組比較法設計貴州木霉NJAU 4742定量PCR特異性引物的方法

有效

• 申請號: 201810768488.0
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN108949908B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 沈其榮;張楊;李榮;蔡楓;張建;龐冠
• 申請（專利權）人: 南京農業大學;南京農業大學淮安研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/885
• 代理公司: 32218 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明公開了一種兩步基因組比較法設計貴州木霉NJAU 4742定量PCR特異性引物的方法。本發明首先將NJAU 4742全基因組序列在NCBI和JGI數據庫中比對，選出沒有匹配的大于500bp的基因組片段，再將篩選得到的片段與同種菌株916的全基因組比對，設計出系列具獨特堿基的引物序列。同時，還選用gfp標記菌株gfp?NJAU 4742中插入的標記片段設計的三對引物作為對基于基因組設計的引物特異性的檢驗標準。通過同屬不同種菌株擴增特異性檢驗、土壤添加再檢測、盆栽土壤實際檢測等步驟，篩選出最優的定量PCR引物。本發明的引物設計方法和設計的菌株特異性引物能夠為其他菌株的定量PCR特異性引物設計和貴州木霉NJAU 4742的定量提供方法。

技術領域

本發明屬于農業微生物領域，涉及對一株貴州木霉NJAU 4742的定量PCR技術的特異性引物的設計及應用。

背景技術

在過去的十幾年中，對目標植物有利生長的研究中已經將大量功能性微生物菌劑直接接種到土壤中或與有機肥料結合作為土壤改良劑。因此，接種菌株在新環境中的存活在其功能表現上起著關鍵作用，因為有效的定殖是功能菌株刺激植物生長或對土壤微生物生態系統有利誘導的根本前提。

傳統上選擇性培養基多被用于檢測或分離環境中的有益促生菌，然而，該方法靈敏度較低且耗時，并且對于形態上相似度極高的真菌種難以準確識別。基于DNA分析，定量PCR(qPCR)技術可以準確定量土壤中多種微生物的豐度，已成為當前分子生物學及微生物生態學研究和應用中使用最多的技術之一，其方法利用引物組定量擴增一段不含任何副產物(非特異性DNA)的特異DNA片段的拷貝，因此引物設計是qPCR中至關重要的一環。目前常用的引物設計必須首先尋找到具有特異性的序列(通常的做法是，從文獻中獲取物種特異性基因，并根據其保守的范圍確定其通用性)，然而，從文獻中獲得的所謂“物種特異性基因”往往信息比較滯后，并未基于不斷增長的基因組數據進行必要的更新，導致基于該基因序列獲得的引物在實際應用中不一定能確保其特異性。有研究者基于木霉屬共有的內部轉錄組間隔區(ITS)對木霉菌屬設計引物且在不同的土壤中進行檢測和定量；然而，這對于木霉種的區分是不夠特異的。也有研究者利用SCAR標記技術能夠對物種進行準確鑒定和監測，然而此分子方法基于對RAPD序列的分析，這是十分費時費力的過程。

木霉菌屬的真菌在土壤中廣泛存在，被認為是一種理想的生物防治劑，具有特定的生物防治機制，包括產生抗生素，具有競爭及誘導抗性等。同時，一些具有根際定殖能力的木霉菌株通過增加養分吸收以及刺激植物防御生物和非生物損害為植物生長提供直接或間接的促進作用。貴州木霉屬于哈茨木霉菌種的亞種，貴州木霉NJAU 4742在國內已被廣泛應用于商業生物制劑的固體發酵和生物肥料開發(專利申請號200910233576.1，CN201610003589.X和CN201610440785.3)。該菌株具有較強的促進植物生長的能力并含有多種優勢基因。因此，探索來自功能性菌株貴州木霉4742的新型產品的開發以及通過定量PCR技術監測其在植物根系的動態變化，揭示其在農業生產實踐的潛在促生機制尤為重要。

發明內容

本發明旨在針對現有實時定量PCR特異性引物設計技術的局限，提供一種兩步比較基因組法，基于真菌特異性片段設計菌株特異性定量PCR引物的方法；并利用兩步比較基因組法設計了貴州木霉NJAU 4742的菌株特異性定量PCR引物。

一種兩步基因組比較設計貴州木霉NJAU 4742定量PCR特異性引物的方法；包括如下步驟：

(1)將NJAU 4742全基因組序列在NCBI和JGI數據庫中比對，選出沒有匹配的大于500bp的基因組片段，