[發(fā)明專利]一種基于長(zhǎng)片段測(cè)序檢測(cè)HIV耐藥位點(diǎn)突變序列多樣性的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810767900.7
• 申請(qǐng)日: 2018-07-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110714095A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王樹(shù)偉;趙仕蘭;肖云平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12R1/93
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于長(zhǎng)片段測(cè)序檢測(cè)HIV耐藥位點(diǎn)突變序列多樣性的方法，涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域，方法包括HIV病毒RNA抽提，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)HIV的耐藥位點(diǎn)序列所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增目的片段；以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用第二輪擴(kuò)增引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增得到第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物；以第二輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第三輪擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化定量，等摩爾量混合后進(jìn)行三代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建并上機(jī)測(cè)序；對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到每個(gè)樣本中所包含的序列信息。本發(fā)明可以高通量長(zhǎng)讀長(zhǎng)完成多樣本中混合的多分子的序列檢測(cè)，提高了HIV的耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)效果、效率及準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種于長(zhǎng)片段測(cè)序檢測(cè)HIV耐藥位點(diǎn)突變序列多樣性的方法。

背景技術(shù)

人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一種可感染人類免疫系統(tǒng)的慢病毒，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞可導(dǎo)致艾滋病發(fā)生。

HIV病毒具有2條相同的正鏈RNA在5’端通過(guò)氫鍵相互連接在一起形成二聚體，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄后生成cDNA，與人體細(xì)胞的基因組整合實(shí)現(xiàn)病毒的復(fù)制。由于在HIV的復(fù)制過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄酶的保真性較差，缺乏3’-5’端外切核酸的校正功能，基因轉(zhuǎn)錄在人體免疫或抗HIV藥物壓力下容易產(chǎn)生錯(cuò)亂，而導(dǎo)致基因突變，因此HIV病毒具有高突變率、高重組率和高復(fù)制率的特性，而高不穩(wěn)定的存在為HIV的治療帶來(lái)很大困難，因此對(duì)與HIV的耐藥區(qū)進(jìn)行核酸序列鑒定是治療HIV的一種手段。目前對(duì)HIV的耐藥去進(jìn)行核酸序列測(cè)定比較多的使用PCR方法將耐藥位點(diǎn)序列擴(kuò)增出來(lái)直接進(jìn)行一代測(cè)序或者生成克隆后對(duì)多個(gè)克隆進(jìn)行一代測(cè)序，在使用PCR產(chǎn)物進(jìn)行一代測(cè)序時(shí)，由于測(cè)序方法靈敏度的限制，突變頻率較低的序列在測(cè)序峰圖上也不能被檢測(cè)到，而且PCR產(chǎn)物序列的多樣性導(dǎo)致一代測(cè)序難度加大。通過(guò)制備成質(zhì)粒并對(duì)多個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序是一種方法，但是此法需要測(cè)定大量質(zhì)粒，且不能保證對(duì)所有突變狀態(tài)都檢測(cè)到。另外，二代測(cè)序能夠?qū)崿F(xiàn)多種序列的覆蓋，但是由于讀長(zhǎng)較短，后續(xù)的數(shù)據(jù)拼接難度較高，不能真實(shí)還原原序列的狀態(tài)。

因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開(kāi)發(fā)一種對(duì)HIV耐藥區(qū)進(jìn)行長(zhǎng)片段高通量測(cè)序的技術(shù)，以期解決上述問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提出了一種基于長(zhǎng)片段測(cè)序檢測(cè)HIV耐藥位點(diǎn)突變序列多樣性的方法，所述方法主要包括以下步驟：

(1)根據(jù)HIV耐藥位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)第一輪擴(kuò)增引物，在第一輪引物的外側(cè)加一段通用堿基序列形成第二輪擴(kuò)增引物，第三論引物包括第二輪引物的通用序列的一部分、若干個(gè)堿基的樣本標(biāo)記序列及若干個(gè)保護(hù)堿基，并合成三輪擴(kuò)增引物；

(2)抽提HIV病毒的RNA，并用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄形成cDNA；

(3)用步驟(1)合成的第一輪擴(kuò)增引物，對(duì)步驟(2)形成的cDNA進(jìn)行HIV耐藥位點(diǎn)的擴(kuò)增，產(chǎn)生第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物；

(4)用步驟(1)合成的第二輪擴(kuò)增引物，對(duì)步驟(3)所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，獲得第二輪PCR產(chǎn)物；

(5)用步驟(1)合成的第三輪擴(kuò)增引物，對(duì)步驟(4)所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第三輪擴(kuò)增，獲得第三輪PCR產(chǎn)物；

(6)對(duì)步驟(5)所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化定量，并等摩爾量混合；

(7)對(duì)步驟(6)所得混合產(chǎn)物進(jìn)行長(zhǎng)片段文庫(kù)構(gòu)建；

(8)對(duì)步驟(7)所產(chǎn)生的文庫(kù)利用PacBio機(jī)器測(cè)序，產(chǎn)生數(shù)據(jù)；

(9)對(duì)步驟(8)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到目的信息。