[發明專利]一種基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法

在審

• 申請號: 201810767900.7
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN110714095A
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發明（設計）人: 王樹偉;趙仕蘭;肖云平
• 申請（專利權）人: 上海歐易生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12R1/93
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• 代理人: 暫無信息

1.一種基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)根據HIV耐藥位點序列設計第一輪擴增引物，在第一輪引物加一段通用堿基序列作為第二輪擴增引物，第三輪擴增引物包括第二輪引物的通用堿基序列的一部分、若干個堿基的樣本標記序列及若干個保護堿基，并合成三輪擴增引物；

(2)抽提HIV病毒的RNA，并用隨機引物進行反轉錄形成cDNA；

(3)用步驟(1)合成的第一輪擴增引物，對步驟(2)形成的cDNA進行HIV耐藥位點的擴增，產生第一輪擴增產物；

(4)用步驟(1)合成的第二輪擴增引物，對步驟(3)所產生的PCR產物進行第二輪擴增，獲得第二輪PCR產物；

(5)用步驟(1)合成的第三輪擴增引物，對步驟(4)所產生的PCR產物進行第三輪擴增，獲得第三輪PCR產物；

(6)對步驟(5)所獲得的PCR產物進行純化定量，并等摩爾量混合；

(7)對步驟(6)所得混合產物進行長片段文庫構建；

(8)對步驟(7)所產生的文庫利用PacBio機器測序，產生數據；

(9)對步驟(8)所產生的數據進行數據分析，得到目的信息。

2.根據權利要求1所述的基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于步驟(1)中需要設計合成三輪擴增引物，第一輪擴增引物根據HIV的耐藥位點序列設計，第二輪擴增引物是第一輪引物序列的5’末端加上若干堿基序列的通用引物，兩者組合形成第二輪擴增引物，第三輪引物是將第二輪引物的5’末端所加的通用引物的一部分并在該段引物的5’末端加上14-20個堿基作為樣本標記引物，在標記引物的5’端再加1-10個堿基作為保護堿基形成第三輪擴增引物。

3.根據權利要求1所述的基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于步驟(2)中反轉錄的引物使用隨機引物進行cDNA的合成。

4.根據權利要求1所述的基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于步驟(3)至步驟(5)三輪PCR擴增所需建庫的樣本。

5.根據權利要求1所述的基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于步驟(6)將步驟(5)所得的PCR產物純化定量，并做等摩爾量混合。

6.根據權利要求1所述的基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于步驟(7)對步驟(6)所得的混合擴增產物進行長片段建庫，建庫步驟包括消化擴增模版的單鏈核酸，補平末端，末端加A以及連接測序接頭。

7.根據權利要求1所述的基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于步驟(8)對步驟(7)所產生的文庫進行上機測序，上機步驟包括。

8.根據權利要求1所述的基于長片段測序檢測HIV耐藥位點突變序列多樣性的方法，其特征在于步驟(9)對于步驟(8)所產生的數據進行數據分析，得到目的信息。