[發明專利]一種pnCasPA-BEC質粒及其應用

在審

• 申請號: 201810767194.6
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN109022477A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 季泉江;陳未中
• 申請（專利權）人: 上海科技大學
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N1/21;C12N15/10;C12R1/19;C12R1/385;C12R1/40;C12R1/38
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩;王婧

本發明提供了一種pnCasPA?BEC質粒及其應用。所述的pnCasPA?BEC質粒，其特征在于，含有能夠表達APOBEC1?nCas9的基因片段、假單胞菌中的質粒復制子mSF以及大腸桿菌中的質粒復制子ColE1。本發明能夠高效并且快速地將各種假單胞菌株基因組上任意位點的胞嘧啶突變成胸腺嘧啶，實現氨基酸突變和基因失活等。所述技術在研究假單胞菌的生理特性、代謝產物、工業生產應用等方面具有廣闊地應用前景。

技術領域

本發明涉及一種pnCasPA-BEC質粒及其應用。

背景技術

假單胞菌(Pseudomonas)是一種常見的革蘭氏陰性變形桿菌，廣泛存在于環境，例如泥土、水、植物和人體中。假單胞菌在生物化學、生態學及工業生產上都具有重要意義，是微生物研究的重點之一。例如，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是一種重要的人類病原菌，很容易造成囊性纖維化、嚴重燒傷。艾滋病、癌癥等免疫力低下患者的臨床感染。惡臭假單胞菌(P.putida)是一種常見的土壤細菌，已經被廣泛應用于環境生物修復和高附加值化學物質生產。科學家們在代謝工程方面對惡臭假單胞菌進行了大量的研究，促進了其化學物質的生產能力和對惡劣環境的耐受性，使其具有很高的工業生產價值。而丁香假單胞菌(P.syringae)則是一種植物病原菌，是研究病原菌與植物之間相互關系的模式菌株。

假單胞菌的基礎生理學研究和應用研究都需要快速高效的基因組編輯工具。但是假單胞菌中傳統的基因組編輯仍然是一項費時費力的工作。CRISPR/Cas9系統是一種最新開發的基因編輯工具，它來源于細菌的免疫防御系統，目前已經被應用于一系列的生物體中，包括哺乳動物細胞、斑馬魚、釀酒酵母、大腸桿菌等。在這個系統中，Cas9核酸酶與引導RNA(sgRNA)結合形成復合物，通過sgRNA上的20個核苷酸與基因組上目標基因位點之間的堿基互補配對作用進行精確定位。在結合后，Cas9核酸酶會切割目標基因位點，在基因組上造成雙鏈斷裂。利用同源重組修復機制，CRISPR/Cas9系統能在一步操作中就實現精確的基因組編輯。

最近開發的堿基編輯器基于CRISPR/Cas9系統，能對基因組上的任意堿基進行編輯，為生物技術開創了一條新的基因組編輯道路。堿基編輯器主要是由一個缺陷型的Cas9蛋白(Cas9D10A或者Cas9D10AH840A)和一個結合到Cas9蛋白上的脫氨酶構成。在Cas9/sgRNA復合物的介導下，脫氨酶能夠定位到基因組上的任意位點進行堿基編輯。這個系統直接通過脫氨反應催化堿基的轉變，不產生DNA雙鏈斷裂，不需要同源修復模板。目前開發的胞嘧啶編輯器，將胞啶脫氨酶APOBEC1連接到缺陷型的Cas9D10A蛋白上，能夠高效地將胞嘧啶(C)轉變成胸腺嘧啶(T)。通過催化CAA、CAG、CGA、TGG轉變成TAA、TAG、TGA，能夠在目標基因上提前產生終止密碼子，從而使基因失去活性。

堿基編輯器技術能夠極為快速并且準確地靶向突變基因組上的堿基。伴隨著大規模DNA微陣列合成技術的突破性發展，此技術能夠在基因組層面或特定基因群實現大規模基因失活，大大提高了功能基因篩選的效率。目前，該技術已經在哺乳動物細胞、植物、大腸桿菌等生物體中實現了高效的堿基編輯，但在假單胞菌中還沒有得到應用。因此通過工程化和改造堿基編輯器體系，使其能夠適用于假單胞菌中的基因組堿基編輯，將極大簡化假單胞菌的遺傳學操作，還將提升功能性基因的篩選效率，為研究假單胞菌的基因功能提供了有力的工具，為后續的基因生物學功能研究、藥物靶標發現、工業化改造等打下基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種pnCasPA-BEC質粒及其應用，其能夠高效并且快速地將各種假單胞菌株基因組上任意位點的胞嘧啶突變成胸腺嘧啶，實現氨基酸突變和基因失活等。

為了達到上述目的，本發明提供了一種pnCasPA-BEC質粒，其特征在于，含有能夠表達APOBECl-nCas9的基因片段以及假單胞菌中的質粒復制子(mSF)。

優選地，所述的pnCasPA-BEC質粒還含有大腸桿菌中的質粒復制子(ColEl)。