[發(fā)明專利]一種多糖測定分析方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810767034.1
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN110715997B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紹平;趙靜;鄧勇
• 申請（專利權(quán)）人: 李紹平
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 張艷美;郝傳鑫

本發(fā)明提供一種多糖測定分析方法，包括以下步驟：(1)多糖酶解，使用內(nèi)切酶對多糖樣品進(jìn)行酶解，獲得酶解產(chǎn)物；(2)衍生化，使用衍生化試劑對所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行衍生化處理；(3)測定分析，采用UPLC?MS或/和UPLC?FLR對衍生化處理后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離、得到色譜圖，隨后對色譜峰特征信息進(jìn)行分析，獲得多糖信息。本發(fā)明提供的多糖的測定方法可以克服現(xiàn)有技術(shù)中對水解得到的特征寡糖片段分離度差、易受共流出組分影響等不足。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及糖類測定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種多糖測定分析方法及其在菌類中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

多糖是由10個(gè)以上的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物。1969年，日本的千原從香菇中分離出抗腫瘤活性的多糖掀起了一股從食用菌中尋找抗腫瘤成分的高潮。實(shí)際上，真菌多糖因其顯著的生物活性如免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化和抗炎抗病毒等確已引起了人們廣泛的關(guān)注[陳忠杰，等.廣西輕工業(yè)，2007，6：5-6；李慧芬，等.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，5：77-80]。目前，已報(bào)道的主要活性菌物多糖有香菇、猴頭菇、靈芝、銀耳、黑木耳、冬蟲夏草、靈芝多糖、灰樹花等。然而，由于多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與組成，其質(zhì)量控制一直是其應(yīng)用開發(fā)的瓶頸。多糖的分子量、組成單糖、構(gòu)象及糖苷鍵鏈接等與其活性密切相關(guān)，如何快速準(zhǔn)確地鑒別及定量分析多糖是多糖產(chǎn)業(yè)化過程中的關(guān)鍵問題。為此，我們先后建立了基于多糖特異酶解反應(yīng)及其產(chǎn)物特征的多糖“糖譜法”[中國專利ZL200910031276.5]和基于多糖dn/dc值的多糖定量方法[中國專利ZL201410172342.1]。由于分離鑒定技術(shù)對糖譜法準(zhǔn)確鑒定不同來源多糖至關(guān)重要，而dn/dc存在無法克服共流出多糖組份對定量準(zhǔn)確性的影響。為此，本發(fā)明采用針對活性多糖結(jié)構(gòu)特征的定性鑒別及定量分析方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于酶解特征寡糖片段的高分離度的多糖測定分析方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種多糖測定分析方法，包括以下步驟：

(1)多糖酶解，使用內(nèi)切酶對多糖樣品進(jìn)行酶解，獲得酶解產(chǎn)物；

(2)衍生化，使用衍生化試劑對所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行衍生化處理；

(3)測定分析，采用UPLC-MS或/和UPLC-FLR對衍生化處理后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離、得到色譜圖，隨后對色譜峰特征信息進(jìn)行分析，獲得多糖信息。

具體地，步驟(1)中所述內(nèi)切酶選自β-1,3(4)-葡聚糖內(nèi)切酶、β-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶、β-1,4-半乳聚糖內(nèi)切酶、右旋糖酐酶、阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、α-淀粉酶和異淀粉酶中的一種或多種。每1mg多糖所使用的酶的用量范圍為1～650U。內(nèi)切酶的類型可根據(jù)所測多糖樣品中結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行選擇，如香菇多糖中糖苷鍵主要含β-1,3-葡聚糖苷鍵，就選擇β-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶水解香菇多糖。

具體地，步驟(2)中所述衍生化試劑選自2-AB(2-氨基苯甲酰胺)、2-AA(2-氨基苯甲酸)、ABBE(對氨基苯甲酸酯)、AMAC(2-氨基吖啶酮)、ANTS(8-氨基萘-1,2,6-三磺酸)、APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸鹽)、3-AQ(3-氨基喹啉)或2-AP(2-氨基吡啶)。衍生化是指采用還原胺化、與吡唑啉酮類、肼類試劑反應(yīng)、氨基衍生化、羥基衍生化、羧基衍生化，衍生化試劑具體根據(jù)所測多糖樣品需進(jìn)行的衍生化操作進(jìn)行選擇。

具體地，步驟(2)包括以下步驟：

a)將衍生化試劑溶于DMSO/乙酸溶液中，獲得的衍生化試劑濃度為0.01-0.2M；

b)用步驟a)中獲得的衍生化試劑溶液配制硼氫化鈉溶液，使得硼氫化鈉的最終濃度為0.1-1M，配制完成后獲得所述衍生化試劑溶液；