[發明專利]一種多糖測定分析方法及其應用

有效

• 申請號: 201810767034.1
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN110715997B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 李紹平;趙靜;鄧勇
• 申請（專利權）人: 李紹平
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 張艷美;郝傳鑫

1.一種多糖中寡糖的測定分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）多糖酶解，使用內切酶對多糖樣品進行酶解，獲得酶解產物；

（2）衍生化，使用衍生化試劑對所述酶解產物進行衍生化處理；

（3）測定分析，采用UPLC-MS或/和UPLC-FLR對衍生化處理后的酶解產物進行分離、得到色譜圖，隨后對色譜峰特征信息進行分析，獲得多糖信息，

步驟（3）中采用所述UPLC-FLR對衍生化處理后的酶解產物進行定量分析，選擇標準低聚糖或純化的酶解特征片段寡糖為對照品，根據色譜峰峰面積及保留時間，對多糖中的寡糖進行定量分析，

其中，步驟（1）中所述內切酶選自β-1,3(4)-葡聚糖內切酶、β-1,3-葡聚糖內切酶、β-1,4-半乳聚糖內切酶、右旋糖酐酶、阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、α-淀粉酶和異淀粉酶中的一種或多種，

步驟（2）中所述衍生化試劑選自2-氨基苯甲酰胺，

步驟（3）中UPLC-MS色譜條件如下：

a）色譜柱，Waters UPLC BEH Glycan，2.1 × 150mm id，1.7μm，柱溫60℃，流動相為0.5%甲酸-水溶液A和乙腈B，梯度洗脫，程序為80% ? 56% B，0 ? 30 min，56% ? 0% B，30–34 min，0%? 0% B，34 – 37 min，0%? 80% B，37 – 40 min，80% B平衡5 min，流速0.5 mL/min，進樣量1 μL；

b）質譜條件，電噴霧離子化ESI，正離子模式，電壓 + 4 kV, 氮氣干燥氣流速 10 L/min, 干燥溫度 250 ℃，

步驟（3）中UPLC-FLR色譜條件如下：

a）色譜柱為Waters UPLC BEH Glycan，2.1 × 150 mm id，1.7 μm，柱溫60℃，流動相為100 mM 甲酸銨，pH 4.5A和乙腈B，梯度洗脫，程序為25% ? 50% A，0 – 46.5 min，50% ?100% A，46.5– 48 min，100%A，48 – 49 min，100%? 25% A，49 – 50 min， 25% A平衡10min，流速0.5 mL/min，進樣量1 μL；

b）熒光檢測器，激發波長330 nm，檢測波長420 nm。

2.如權利要求1所述的多糖中寡糖的測定分析方法，其中，步驟（2）包括以下步驟：

a）將衍生化試劑溶于DMSO/乙酸溶液中，獲得的衍生化試劑濃度為0.01-0.2 M；

b）用步驟a）中獲得的衍生化試劑溶液配制硼氫化鈉溶液，使得硼氫化鈉的最終濃度為0.1-1 M，配制完成后獲得所述衍生化試劑溶液；

c）取步驟b）中獲得的衍生化試劑溶液加入酶解后的酶解產物中，水浴反應，反應完成后，采用離心處理，取上清液與乙腈混合，混合后采用Glycoworks HILIC固相萃取柱去除其中過量的衍生化試劑，得到衍生化試劑衍生化后的酶解產物。

3.如權利要求1所述的多糖中寡糖的測定分析方法，其中，步驟（3）中采用所述UPLC-MS對衍生化處理后的酶解產物進行定性分析，根據色譜峰和保留時間，或以質譜色譜峰質荷比及二級質譜碎片特征，通過數據庫比對進行色譜峰的識別與鑒定。

4.如權利要求1至3任一項所述的多糖中寡糖的測定分析方法在菌類中的應用。

5.如權利要求4所述的多糖中寡糖的測定分析方法在菌類中的應用，其中，所述菌類多糖樣品的制備方法包括以下步驟：

（1）菌類多糖提取，將所述菌類干燥、打粉后加入水使得料液比1:20，水熱平行提取，獲得菌類初樣；

（2）水提液濃縮，取步驟（1）中獲得的菌類初樣，加入乙醇沉淀，靜置，離心，保留沉淀，加水復溶，冷凍干燥得到粗多糖；

（3）將步驟（2）中的粗多糖加去離子水配成溶液，轉入超濾離心管，離心，棄濾液，采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測濾液中糖含量，將截留液冷凍干燥，得到所述菌類多糖樣品。