[發明專利]一種茶樹鮮葉茸毛的提取方法及其應用

在審

• 申請號: 201810765261.0
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN108913648A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 岳川;曹紅利;孫云;林宏政;葉乃興
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;林文弘

本發明提供了一種快速提取茶樹鮮葉茸毛的方法及其應用，具體步驟如下：（1）取帶茸毛的茶樹芽或葉片等鮮嫩組織，自然放入50ml離心管，在液氮中快速冷凍；（2）手握冷凍后的離心管樣品在旋渦混合器上連續振動20s~30s，使樣品表面的茸毛摩擦脫落并附著在管壁和管底上；（3）用液氮冷凍過的藥匙迅速將附著于管壁和管底上的茸毛刮下，放入液氮冷凍的離心管中保存，重復數次，直至收集到所需量的茸毛。本方法提取出的茸毛樣品，最大程度上保持了樣品的新鮮，提取出的茸毛能夠用于RNA提取，可以用于分子生物學研究和代謝物分析，為茶樹茸毛的研究奠定基礎。

技術領域

本發明涉及一種茶樹鮮葉組織茸毛的提取方法及其應用。

背景技術

茶樹（Camellia sinensis (L.)O. Kuntze）是我國一種重要的多年生常綠經濟作物，其幼嫩芽葉經不同加工工藝可以制成不同茶類。茸毛是茶樹幼嫩芽葉組織特有的物質。通常茸毛越多的茶葉其加工的原料更加幼嫩，茸毛中也含有一定量的茶氨酸、茶多酚、咖啡堿等茶葉特異成分，同時也含有豐富的微量元素和揮發性物質（宋亞康等，2017；葉乃興等，2010；尹鵬等，2018），因此，茸毛的有無及多少與茶葉的品質密切相關。目前對茶樹茸毛的研究主要集中在生化成分測定上，且所測定的茸毛主要是從成品茶中經研磨和分篩后提取出來的，這種茸毛不僅經過了長時間的加工和研磨處理，還混有部分茶葉粉末，嚴重干擾了茶樹中茸毛物質的組成及含量測定。同時，這樣從成品茶中提取出的茸毛也不可以用于從分子生物學水分研究茶樹茸毛。要準確測定茶樹茸毛的生化成分及開展茸毛的分子生物學研究，首先必須能夠從鮮葉上提取新鮮的茸毛，并保證茸毛始終在低溫條件下，避免物質轉化及RNA等的降解。但至今沒有一種理想的方法用于提取茶樹鮮葉中的茸毛。所以，如何提供一種能夠在低溫條件下快速提取茶樹鮮葉茸毛的方法是開展茶樹茸毛研究急需解決的關鍵難題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種在低溫條件下快速提取茶樹鮮葉茸毛的方法，為茶樹茸毛物質代謝和分子生物學研究奠定基礎。

為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：

要求：提取中所用的離心管、藥匙都需液氮冷凍，并維持在低溫狀態；樣品要求有茸毛的單芽、一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉茶樹鮮葉樣品；樣品裝入冷凍的離心管，在離心管中的體積不超過離心管體積的2/3；握住樣品在旋渦混合器上振動，振動頻率在1200~2800r/min，每次液氮冷凍后提取時間不超過30s，如一次未將茸毛脫落凈，可用液氮冷凍處理后重復提取。

一種茶樹鮮葉茸毛的提取方法，具體包括如下步驟：

（1）取單芽、一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉的茶樹鮮葉，取下含茸毛的葉片和芽組織，自然舒展裝入50ml離心管中，樣品體積不超過離心管體積的2/3，擰緊離心管蓋子，放入液氮中快速冷凍50s~150s；

（2）迅速從液氮中取出步驟（1）的裝樣品的離心管，用手握住置于旋渦混合器上連續振動20s~30s，通過振動作用將茸毛抖動脫落，脫落后的茸毛將黏于管壁和管底上；

（3）另取一個離心管放入液氮中冷凍，快速擰開步驟（2）的離心管蓋子，用液氮冷凍過的藥匙迅速刮下黏在管壁上的茸毛，將茸毛轉入液氮冷凍著的離心管中，倒掉提取過的樣品，再用藥匙將管底的茸毛取出，迅速放入裝茸毛的冷凍離心管中；

（4）重復步驟（1）-（3）多次，提取獲得所需量的茸毛，茸毛樣品放入-80℃超低溫冰箱保存備用。

步驟（2）中旋渦混合器的振動頻率1200~2800 r/min。

其中，步驟（1）中的樣品體積不超過離心管體積的2/3，樣品需液氮冷凍完全后（50s~150s）再進行振動；步驟（2）中，振動時需保持離心管處于低溫狀態，因此需要短時快速振動，振動頻率1200~2800r/min，每次冷凍樣品振動時間不超過30s；提取過程中所用的離心管、藥匙等均應用液氮冷凍，保持低溫狀態。