[發明專利]一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液及其反應體系和PCR方法

有效

• 申請號: 201810763947.6
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN108998506B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 于洪波
• 申請（專利權）人: 深圳市梓健生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 深圳市瑞方達知識產權事務所(普通合伙) 44314
• 代理人: 張秋紅;郭方偉

本發明涉及一步法實時熒光RT?PCR反應緩沖液及其反應體系和PCR方法,該一步法實時熒光RT?PCR反應緩沖液包括如下原料：三羥甲基氨基甲烷?鹽酸緩沖液、氯化鉀、氯化鎂、硫酸銨、二甲基亞砜、脫氧核糖核苷三磷酸、甘油、牛血清蛋白、吐溫20、三氮化鈉、Rox參比染料、去離子水。該一步法實時熒光RT?PCR反應緩沖液增加了NH4⁺和N₃^?，提高PCR反應效率，適用于PCR技術的高效擴增型和靈敏檢測，其不僅具有穩定性好，熒光效果佳、靈敏度高的優點。該實時熒光PCR方法，通過采用一步法實時熒光RT?PCR反應緩沖液配置成熒光RT?PCR反應體系，其具有結果可靠和準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本，提高檢查效率等優點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地說，涉及一種一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液及其反應體系和PCR方法。

背景技術

實時熒光PCR技術是近年來應用最廣泛的一種實時在線的檢測技術，既能夠定性，又能夠定量，是近年來進行檢測的新的“黃金標準”。

實時熒光PCR根據化學原理的不同可分為探針法和染料法。其中Taqman實時熒光技術以Taqman水解探針為基礎。當探針完整時，5’端熒光基團發射的熒光信號被3’端淬滅基團吸收而不發光；當探針被具有5’-3’外切酶活性的Taq酶降解時，熒光基團和淬滅基團分離，發射出的熒光就可以被熒光PCR檢測到。在熒光PCR的檢測中，RNA的熒光RT-PCR檢測應用最廣泛。熒光RT-PCR檢測步驟首先是逆轉錄酶將RNA逆轉錄成cDNA，Taq酶可以催化5’至3’方向的依賴于cDNA模板的脫氧核苷酸的聚合，同時具有5’-3’外切酶活性的Taq酶在進行PCR擴增時將探針進行剪切，同時釋放出熒光信號。

《一種熒光定量PCR反應液及熒光定量PCR方法》，申請號為CN201010538264.4，公開了在常規的PCR反應液中增加了包括二甲基亞砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亞精胺、硫酸銨和甜菜堿中的一種或多種作為熒光PCR的反應增強劑。《熒光定量PCR反應液及試劑盒和熒光定量PCR方法》，申請號為CN201410578009.0，公開了在SYBR染料熒光PCR反應液中加入了酶的保護劑和穩定劑二甲基亞砜、牛血清蛋白和甘油。《一種熒光定量PCR反應液及方法》，申請號為CN201610958965公開了在常規的PCR緩沖液中加入了熒光穩定劑(NP-40、Triton X100、NaCl和KCl)和熒光增強劑(牛血清白蛋白、二甲基亞砜、甲酰胺、亞精胺和甜菜堿)。以上專利申請文件其存在PCR反應效率低的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于，提供一種能夠解決PCR反應效率低的一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液及其反應體系和實時熒光PCR方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：構造一種一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液，包括如下體積比的原料：

優選地，各所述原料的終濃度為：

優選地，所述一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液的pH值為6.5～8.5。

本發明還構造一種一步法實時熒光RT-PCR反應體系，包括本發明所述的

一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液，還包括耐熱DNA聚合酶、和/或反

轉錄混合酶，上游引物，下游引物，水解探針，去離子水，RNA模板。

優選地，所述耐熱DNA聚合酶為2～10U/μL。

優選地，所述反轉錄混合酶為50～300U/μL。

優選地，所述耐熱DNA聚合酶為化學修飾的熱啟動耐熱DNA酶、抗體