[發明專利]一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液及其反應體系和PCR方法

有效

• 申請號: 201810763947.6
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN108998506B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 于洪波
• 申請（專利權）人: 深圳市梓健生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 深圳市瑞方達知識產權事務所(普通合伙) 44314
• 代理人: 張秋紅;郭方偉

1.一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液，其特征在于，包括如下體積比的原料：

其中，所述硫酸銨的終濃度為20～40mM；

所述三氮化鈉的終濃度為4.5×10^-2～9×10^-2mM。

2.根據權利要求1所述的一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液，其特征在于，各所述原料的終濃度為：

3.根據權利要求1所述的一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液，其特征在于，所述一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液的pH值為6.5～8.5。

4.一步法實時熒光RT-PCR反應體系，其特征在于，包括權利要求1至3任意一項所述的一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液，還包括耐熱DNA聚合酶、和/或反轉錄混合酶，上游引物，下游引物，水解探針，去離子水，RNA模板。

5.根據權利要求4所述的一步法實時熒光RT-PCR反應體系，其特征在于，所述耐熱DNA聚合酶濃度為2～10U/μL。

6.根據權利要求4所述的一步法實時熒光RT-PCR反應體系，其特征在于，所述反轉錄混合酶濃度為50～300U/μL。

7.根據權利要求4所述的一步法實時熒光RT-PCR反應體系，其特征在于，所述耐熱DNA聚合酶為化學修飾的熱啟動耐熱DNA酶、抗體修飾的熱啟動耐熱DNA酶的一種或多種。

8.根據權利要求4所述的一步法實時熒光RT-PCR反應體系，其特征在于，反轉錄混合酶為AMV反轉錄酶、M-MLV反轉錄酶、SuperScript III逆轉錄酶的混合酶。

9.一種實時熒光PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、制備權利要求1至3任意一項所述的一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液；

S2、向所述一步法實時熒光RT-PCR反應緩沖液中加入耐熱DNA聚合酶、和/或反轉錄混合酶，上游引物，下游引物，水解探針，去離子水，RNA模板形成熒光RT-PCR反應體系；

S3、將所述熒光RT-PCR反應體系置于45～50℃的溫度條件下進行反轉錄反應；

S4、將反轉錄反應后熒光RT-PCR反應體系置于95℃的溫度條件下進行變性反應；再將其置于55～65℃的溫度條件下進行退火，并于退火延伸時收集熒光信號，依次循環30～45次。