[發明專利]臨床用脂肪干細胞檢測體系

在審

• 申請號: 201810763766.3
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN109097430A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 焦陽;王鐵
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞思坦生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 邢若蘭;高之波

本發明公開了一種臨床用脂肪干細胞檢測體系，該檢測體系包括：擴增曲線的建立、細胞周期檢測、細胞流式檢測、感染性疾病檢測、脂肪干細胞分化能力檢測、細胞旁分泌檢測和動物安全性檢測中任一種或多種組合。是用該體系檢測脂肪干細胞，能夠安全的用于臨床使用。

技術領域

本發明屬于人體干細胞，特別涉及脂肪干細胞檢測。

背景技術

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、ADSC多能細胞是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。主要恢復組織細胞的修復功能，促進細胞的再生，恢復年輕面容的同時，身體機能也得到充分改善，有效改善亞健康、早衰等疾病，由內而外真正的有效抵抗衰老。

SVF(Stromal Vascular Fraction)，中文名血管基質組分，是通過通過抽脂、消化、離心等步驟，從脂肪組織中分離出的多種細胞混合物形成的細胞團。SVF中包含數量豐富的間充質干細胞(ASCs)、高濃度血小板血漿(PRP)、生長因子、紅細胞、白細胞、淋巴細胞、單核細胞等。研究發現，新鮮分離的SVF中的各種細胞之間有一種協同效應，他們之間相互影響并通過自分泌，增加組織的修復能力和創面愈合能力，安全性、有效性極高。SVF來源的脂肪干細胞建立的臨床用脂肪干細胞庫目前研究較少質量不穩定，如何檢測脂肪干細胞的效用及安全性等是目前急需解決的問題。

發明內容

為了解決上述現有各種方法的不足，本發明的目的是提供一種臨床用脂

肪干細胞檢測體系，該檢測體系包括：擴增曲線的建立、細胞周期檢測、細胞流式檢測、感染性疾病檢測、脂肪干細胞分化能力檢測、細胞旁分泌檢測和動物安全性檢測中任一種或多種組合。

根據本發明的一方面，提供了一種臨床用脂肪干細胞檢測體系，其中上述擴增曲線的建立方法為：MTT試劑配制；培養脂肪干細胞：取擴增進入平臺期的P2代脂肪干細胞，96孔板中，置于二氧化碳培養箱中培養，培養至第三天換液一次；每隔24h對干細胞進行MTT檢測，共檢測5天；每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，繼續培養4h；終止培養，小心吸去孔內培養液；每孔加入150ul二甲基亞砜，晃動10分鐘，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

根據本發明的一方面，提供了一種臨床用脂肪干細胞檢測體系，其中上述細胞周期檢測方法為：取P2代脂肪干細胞，培養3天后，細胞匯合度約為90％，用70％冰乙醇固定后的1×105(100μl)，PBS洗兩次，加入PI染液(含RNase)300μl，混勻，避光孵育30分鐘，流式細胞儀檢測。

根據本發明的一方面，提供了一種臨床用脂肪干細胞檢測體系，其中上述細胞流式檢測方法為：檢測細胞免疫表型標志物有：陰性指標CD34、CD45、CD14和HLA-DR；陽性指標CD105、CD49d、CD73、CD90；將收獲的細胞用PBS懸浮，吹打均勻后轉移至15ml離心管中，標明信息，每種標志物均取1×105細胞(100μl)，加入抗體20μl，混勻，避光孵育30分鐘，PBS洗兩次，流式細胞儀檢測。

根據本發明的一方面，提供了一種臨床用脂肪干細胞檢測體系，其中上述脂肪干細胞分化能力檢測包括：成脂實驗、成骨實驗和成軟骨實驗，檢測脂肪干細胞誘導分化為脂、骨、軟骨的生物學效力。

根據本發明的一方面，提供了一種臨床用脂肪干細胞檢測體系，其中上述細胞旁分泌檢測方法為：取各代細胞，使用流式細胞儀檢測分泌蛋白的含量。每孔加標準品或樣品100μL，37℃孵育90分鐘；棄去液體，每孔加入生物素化抗體工作液100μL，37℃孵育1小時；洗板3次加酶結合物工作液100μL，37℃孵育30分鐘。洗板5次，每孔加底物溶液100μL，37℃避光孵育15分鐘左右，加終止液50μL，用酶標儀檢測EGF、bFGF、TGF-β1細胞因子含量(mean±SD)。

附圖說明