[發明專利]臨床用脂肪干細胞檢測體系

在審

• 申請號: 201810763766.3
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN109097430A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 焦陽;王鐵
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞思坦生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 邢若蘭;高之波

1.臨床用脂肪干細胞檢測體系，其特征在于，所述檢測體系包括：擴增曲線的建立、細胞周期檢測、細胞流式檢測、感染性疾病檢測、脂肪干細胞分化能力檢測、細胞旁分泌檢測和動物安全性檢測中任一種或多種組合。

2.根據權利要求1所述的臨床用脂肪干細胞檢測體系，其特征在于，所述擴增曲線的建立方法為：MTT試劑配制；培養脂肪干細胞：取擴增進入平臺期的P2代脂肪干細胞，96孔板中，置于二氧化碳培養箱中培養，培養至第三天換液一次；每隔24h對干細胞進行MTT檢測，共檢測5天；每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，繼續培養4h；終止培養，小心吸去孔內培養液；每孔加入150ul二甲基亞砜，晃動10分鐘，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

3.根據權利要求1所述的臨床用脂肪干細胞檢測體系，其特征在于，所述細胞周期檢測方法為：取P2代脂肪干細胞，培養3天后，細胞匯合度約為90％，用70％冰乙醇固定后的1×105(100μl)，PBS洗兩次，加入PI染液(含RNase)300μl，混勻，避光孵育30分鐘，流式細胞儀檢測。

4.根據權利要求1所述的臨床用脂肪干細胞檢測體系，其特征在于，所述細胞流式檢測方法為：檢測細胞免疫表型標志物有：陰性指標CD34、CD45、CD14和HLA-DR；陽性指標CD105、CD49d、CD73、CD90；將收獲的細胞用PBS懸浮，吹打均勻后轉移至15ml離心管中，標明信息，每種標志物均取1×10⁵細胞(100μl)，加入抗體20μl，混勻，避光孵育30分鐘，PBS洗兩次，流式細胞儀檢測。

5.根據權利要求1所述的臨床用脂肪干細胞檢測體系，其特征在于，所述脂肪干細胞分化能力檢測包括：成脂實驗、成骨實驗和成軟骨實驗，檢測脂肪干細胞誘導分化為脂、骨、軟骨的生物學效力。

6.根據權利要求1所述的臨床用脂肪干細胞檢測體系，其特征在于：所述細胞旁分泌檢測方法為：取各代細胞，使用流式細胞儀檢測分泌蛋白的含量。每孔加標準品或樣品100μL，37℃孵育90分鐘；棄去液體，每孔加入生物素化抗體工作液100μL，37℃孵育1小時；洗板3次加酶結合物工作液100μL，37℃孵育30分鐘。洗板5次，每孔加底物溶液100μL，37℃避光孵育15分鐘左右，加終止液50μL，用酶標儀檢測EGF、bFGF、TGF-β1細胞因子含量(mean±SD)。