[發明專利]百合花瓣原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 201810762195.1
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN108949665B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 孫明;石雪珺;張啟翔;張騰旬;鐘劍;陳俊通;程堂仁;潘會堂;王佳
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明公開了百合花瓣原生質體的制備方法，包括步驟：(1)取帶有未開放花蕾的百合植株，進行暗處理；(2)取植株的內輪花瓣，清洗、消毒；(3)向花瓣材料中加入酶解溶液，于暗處真空抽提，然后暗處靜置酶解數小時，得到含有花瓣原生質體的酶解液；(4)所得酶解液用W5溶液稀釋，網篩過濾，所得濾液經低速離心，棄上清，用W5溶液重懸原生質體沉淀，低速離心，棄上清，重復洗一次；用MMG溶液重懸原生質體沉淀。本發明克服了百合花瓣原生質體分離效率低的問題，有效建立了百合花瓣原生質體制備的方法。

技術領域

本發明涉及植物原生質體制備技術，具體地說，涉及百合花瓣原生質體的制備方法。

背景技術

百合(Lilium spp.)為百合科百合屬的多年生球根花卉，是世界著名的觀賞花卉。原生質體指的是去除細胞壁的由質膜包被的裸露細胞。原生質體具有細胞全能性，可再生成完整的植株。原生質體的分離作為基因工程的一項基礎技術手段，對于百合相關基因功能研究，遺傳育種等具有重要意義。

百合作為高度雜合的單子葉植物，原生質體分離培養的難度較大，目前國內外有關百合原生質體制備的研究報道葉較少。Horita通過分離東方百合和鐵炮百合的原生質體，以看護培養的方式于2002年首次成功培育初百合體細胞雜交再生植株(Horita M，Morohashi H，Komai F.Regeneration of Flowering Plants From Difficile LilyProtoplasts by Means of a Nurse Culture.Planta[J]，2002，5(215)：880-884)。張寧對岷江百合原生質體制備當中的酶濃度、酶解時間、離心方式、細胞篩目數等參數進行了細致的研究(張寧.百合原生質體分離影響因素的研究[C].園藝學報，2010，37：2188)。在此基礎上，近幾年對于東方百合、野生百合、食用百合等的原生質體分離與純化技術都有一定的報道，但其所用材料多集中于愈傷組織或懸浮細胞，對于直接取材于成熟植株的研究較少，直接取材于花瓣的報道更為罕見。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡單、高效的百合花瓣原生質體的制備方法。

為了實現本發明目的，本發明提供一種百合花瓣原生質體的制備方法，包括以下步驟：

(1)取帶有未開放花蕾的百合植株，進行暗處理；

(2)取步驟(1)經暗處理后植株的內輪花瓣，進行清洗、消毒；

(3)向消毒后內輪花瓣材料中加入酶解溶液，于暗處真空抽提，然后于暗處靜置酶解數小時，得到含有花瓣原生質體的酶解液；

(4)步驟(3)所得酶解液用W5溶液稀釋，然后用網篩過濾，所得濾液經低速離心，棄上清，用W5溶液重懸原生質體沉淀，低速離心，棄上清(在不碰觸原生質體沉淀的情況下盡量去除W5溶液)，再用W5溶液重懸原生質體沉淀，低速離心，用MMG溶液重懸原生質體沉淀；

其中，步驟(3)中酶解溶液的活性成分為纖維素酶和離析酶，二者濃度比為1-2：0.2-1，優選2:0.5。

優選地，步驟(1)中黑暗處理24-72h，優選72h。

前述的方法，步驟(2)中所取花瓣為花蕾期、初花期或盛花期的花瓣，優選初花期花瓣。

優選地，步驟(2)中花瓣消毒的具體方法為：用肥皂水浸泡后流水沖洗，然后用70-75％酒精浸泡5min，無菌水沖洗干凈，吸干水分。

優選地，步驟(3)中酶解溶液的配方為：1-2％纖維素酶R-10、0.2-1％離析酶R-10、1-2％纖維素酶R-10、0.2-1％離析酶R-10、15-20mmol/L氯化鉀、15-20mmol/L 2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸、15-10mmol/L氯化鈣、0.4-0.6mol/L甘露醇和0.1％牛血清蛋白，pH5.7-5.8。以水配制上述酶解溶液后，經0.45μm微孔過濾膜過濾滅菌后使用。