[發(fā)明專利]百合花瓣原生質(zhì)體的制備方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201810762195.1 | 申請(qǐng)日： | 2018-07-12 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN108949665B | 公開（公告）日： | 2022-03-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 孫明;石雪珺;張啟翔;張騰旬;鐘劍;陳俊通;程堂仁;潘會(huì)堂;王佳 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 北京林業(yè)大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N5/04 | 分類號(hào)： | C12N5/04 |
| 代理公司： | 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;黃爽 |
| 地址： | 100083 *** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 百合 花瓣 原生 質(zhì)體 制備 方法 | ||
1.百合花瓣原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)黑暗預(yù)處理：選取狀態(tài)良好無(wú)病蟲害的未開放的東方百合‘索邦’花蕾，剪下并瓶插，室溫下進(jìn)行黑暗處理72h；
(2)材料處理：將步驟(1)所得初開期內(nèi)輪花被片用肥皂水浸泡后流水沖洗，75％酒精浸泡5min，無(wú)菌水沖洗干凈，吸干水分，待用；
(3)酶解處理：將步驟(2)中所得材料用消毒后的刀片切割成2mm寬的條狀，稱取1g條，用鑷子將其置入10ml酶解溶液中；用真空泵于黑暗中抽提30min；在室溫下，黑暗條件中靜置酶解10h；當(dāng)酶解液變色時(shí)輕輕搖晃培養(yǎng)皿促使原生質(zhì)體釋放出來(lái)；
其中，酶解溶液的制備如下：2％纖維素酶R-10、0.5％離析酶R-10、20mmol/L氯化鉀、20mmol/L 2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸、10mmol/L氯化鈣和0.1％牛血清蛋白，并以0.4mol/L的甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，pH調(diào)至5.7，0.45μm微孔過濾膜過濾滅菌后使用；
(4)純化處理：將步驟(3)所得酶解液用等體積的W5溶液稀釋；用W5溶液潤(rùn)濕尼龍網(wǎng)篩，用200目網(wǎng)篩過濾含有花瓣原生質(zhì)體的酶解液；濾液以4℃，700r/min低速離心6min；棄上清，用10ml冰上預(yù)冷的W5溶液輕柔重懸原生質(zhì)體；將重懸液700r/min低速離心6min；在不碰觸原生質(zhì)體沉淀的情況下盡量去除W5溶液，重復(fù)洗一次；以MMG溶液重懸沉淀原生質(zhì)體；顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)；
其中，W5溶液的配方為：2mmol/L 2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸、154mmol/L氯化鈉、125mmol/L氯化鈣、5mmol/L氯化鉀，pH5.7；
MMG溶液的配方為：4mmol/L 2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化鎂，pH5.7。
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