[發(fā)明專利]同時(shí)測(cè)定血漿中姜黃素和5-氟尿嘧啶濃度的HPLC分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810761763.6
• 申請(qǐng)日: 2018-07-12
• 公開（公告）號(hào): CN108956816B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙領(lǐng);皮超;魏郁夢(mèng);徐婷;梁靖;趙仕杰;楊紅茹;郭璞;胡美;左英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/74;G01N30/88
• 代理公司: 重慶華科專利事務(wù)所 50123
• 代理人: 夏洪

本發(fā)明屬于藥物動(dòng)力學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)測(cè)定動(dòng)物血漿中姜黃素和5?氟尿嘧啶濃度的HPLC分析方法。起步驟包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備、樣品預(yù)處理、樣品分離、檢測(cè)樣品峰面積和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法克服了姜黃素和5?氟尿嘧啶的極性相差大，在同一個(gè)色譜體系中不容易洗脫分離的困難，能夠在血漿中同時(shí)測(cè)定姜黃素和5?氟尿嘧啶的濃度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物動(dòng)力學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測(cè)定方法，更具體地，涉及一種同時(shí)測(cè)定動(dòng)物血漿中姜黃素和5-氟尿嘧啶濃度的HPLC分析方法。

背景技術(shù)

姜黃素(CU)是從姜科植物姜黃等的根莖中提取的一種酚類色素，姜黃素為橙黃色結(jié)晶粉末，味稍苦，不溶于水。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用，在抗癌領(lǐng)域具有良好的實(shí)用性和應(yīng)用前景。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種嘧啶類抗癌藥物，同時(shí)也是臨床使用的一線抗腫瘤藥物，對(duì)多種癌癥(如肝，胃，胰腺癌和乳腺癌)都具有較好的療效，但其具有胃腸道毒性、骨髓抑制等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，使其臨床使用受到限制。根據(jù)化療藥物組合原則，將具有光譜抗腫瘤活性的姜黃素與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用，有望達(dá)到協(xié)同增效目的。

藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展及人類健康水平的不斷提高，對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的要求越來(lái)越高，判斷一個(gè)藥物的應(yīng)用前景特別是市場(chǎng)前景，不單純是療效強(qiáng)，毒副作用小，更要具備良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。而藥物在血漿中濃度的檢測(cè)技術(shù)是藥代動(dòng)力學(xué)分析評(píng)估的重要前提技術(shù)。

由于姜黃素和5-氟尿嘧啶的極性相差大，在同一個(gè)色譜體系中不容易洗脫分離，目前還未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道在同一色譜系統(tǒng)中同時(shí)測(cè)定生物樣品中姜黃素和5-氟尿嘧啶含量的分析方法。使用的分析方法中比較常見(jiàn)的有：利用HPLC或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分別檢測(cè)生物樣品中姜黃素和5-氟尿嘧啶含量。比如：

1.取實(shí)驗(yàn)小鼠血漿置于含枸櫞酸葡萄糖的離心管內(nèi)，渦旋離心，吸取上清液置于另一離心管中，貯存于-20℃冰箱，備用。精密吸取血漿樣品，經(jīng)甲醇沉淀后于-20℃過(guò)夜處理，離心(4000rpm，15min)，取適量上清液，進(jìn)HPLC分析。檢測(cè)姜黃素的HPLC色譜條件為：色譜柱：Luna5μm C18；流動(dòng)相：乙腈：乙酸(75：25)；檢測(cè)波長(zhǎng)：429nm。檢測(cè)5-氟尿嘧啶的HPLC色譜條件為：色譜柱：Qualisil BDS C18柱。(5μm,4.6×250mm)；流動(dòng)相：甲醇：水(1：9)；檢測(cè)波長(zhǎng)：262nm。流速1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20μL；在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

2.建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測(cè)定人血漿中5-氟尿嘧啶的濃度。取受試者血漿樣品50μL,加入內(nèi)標(biāo)溶液(500ng/mL的5-溴尿嘧啶溶液)50μL,加甲醇至1000μL,旋渦混合30s,15000r/min低溫4℃離心10min,取上清液氮?dú)獯蹈?100μL流動(dòng)相復(fù)溶,進(jìn)樣分析。色譜條件：采用A gilent-C a8反相色譜柱(2.1mm×150mm，3.5μm)，以甲醇-去離子水(0.1％甲酸)(80：20)為流動(dòng)相，柱溫20℃，流速0.2mL/m in，進(jìn)樣量為1μL。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧負(fù)離子化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行定量分析；離子噴射電壓為5.5kV，離子源溫度為550℃；源內(nèi)氣體1(GS1)壓力為310kPa，源內(nèi)氣體2(GS2)壓力為55lkPa，氣簾氣體壓力為103kPa，5-氟尿嘧啶和內(nèi)標(biāo)5-溴尿嘧啶的DP電壓(解簇電壓)分別為65V；用于定量分析的離子反應(yīng)對(duì)分別為質(zhì)荷比m/z 128.70一m/z 42.0(5-氟尿嘧啶)和m/z 188.60一m/z 42.0(5-溴尿嘧啶，內(nèi)標(biāo))。

雖然相對(duì)于HPLC法，HPLC-MS/MS法體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)的優(yōu)點(diǎn)，但是最大的不足是，用以上分析方法都只能在不同的色譜系統(tǒng)中分別檢測(cè)姜黃素和5-氟尿嘧啶的含量，而沒(méi)有在同一色譜系統(tǒng)中一起分析。