[發明專利]一種乳腺癌PDX構建方法

在審

• 申請號: 201810760063.5
• 申請日: 2018-07-11
• 公開（公告）號: CN110710495A
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發明（設計）人: 何遠橋;陳傳軍
• 申請（專利權）人: 南昌樂悠生物科技有限公司
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種乳腺癌PDX構建方法，包括以下步驟：腫瘤組織樣本的準備、免疫缺陷小鼠乳腺導管內注射接種以及免疫缺陷小鼠常規飼養與觀察。本發明采用乳腺導管內注射的方法，可以將人源乳腺癌微組織塊或乳腺癌原代細胞注射到免疫缺陷小鼠乳腺導管內，構建人乳腺癌原位PDX模型，更符合臨床乳腺癌發生發展的實際，為人類更好的研究乳腺癌提供了便利。本方法也可以用于人源或者鼠源性細胞株乳腺導管內注射構建乳腺癌細胞株移植瘤模型。

技術領域

本發明涉及乳腺癌的治療技術領域，尤其涉及一種乳腺癌PDX構建方法。

背景技術

人源腫瘤異種移植模型（Patient-derived xenografting, PDX）是指將腫瘤病人的新鮮腫瘤樣本接種到免疫缺陷小鼠體內，腫瘤樣本借助小鼠體內生理環境分裂增殖所構建的在體動物模型。PDX模型保留了腫瘤患者腫瘤的異質性、病理特征、基因表達與變異，與患者臨床相關性高，因而有其他腫瘤模型所無法比擬的優勢，對腫瘤個性化治療、腫瘤科學研究和新藥研發意義重大。但是，成功率低、周期長、成本高是阻礙PDX模型廣泛使用的重要瓶頸。

乳腺癌是女性的常見腫瘤。現代研究認為，乳腺癌不是一種單一的疾病，而是作為以組織學，基因組改變，基因表達，轉移行為和治療反應多樣性為特征的疾病異質性集合。除了患者群體之間（或單個患者的兩種原發性腫瘤之間）的腫瘤異質性之外，最近的數據還顯示出相當大的腫瘤內異質性（即在同一個患者單一腫瘤內的細胞之間以及原發腫瘤與其轉移腫瘤之間的差異）。這對于有效治療乳腺癌構成重大阻礙，開發一種基于個體的特定生物學和獨特腫瘤的個性化治療方法成為不二選的治療策略。就基礎研究和轉化研究而言，乳腺癌內部和乳腺癌之間存在的異質性，也對乳腺疾病相關臨床前模型的制作和使用提出了重大挑戰。而PDX模型無疑是應對這一挑戰的有利工具。

科研工作者試圖通過直接用乳腺癌患者腫瘤組織接種到免疫功能低下的小鼠體內建立穩定的可移植的異種移植模型的努力已經持續了數十年。但是建立穩定的可移植模型（一般定義為小鼠PDX模型能夠從P0代連續移植傳代≧3代的能力）成功率只有10%左右。因此，很少有穩定的移植模型可以用于早期研究。近幾年，隨著免疫缺陷小鼠的更新迭代、接種方法的改進，人乳腺癌PDX模型的成功率穩定在了20%左右。

目前常用的乳腺癌接種方法很多，可以將乳腺癌組織或細胞接種到小鼠眼球前室、腎包膜下、肩胛脂肪墊，皮下（耳、面等）或原位的乳腺脂肪墊者注射到乳腺導管內。但上述接種位置均與臨床上乳腺癌的生長環境有很大的差異，不符合乳腺癌發生發展的生理環境，因而應用受限。因為乳腺癌的激素依賴性，為了提高乳腺癌PDX的成功率，也有人選擇給小鼠埋植雌二醇緩釋片來促進小鼠成瘤。雌二醇緩釋片價格高昂，大大增加了成本。

本發明創新性的采用乳腺導管內注射的方法建立乳腺癌原位PDX模型，能夠將乳腺癌細胞或組織塊接種至乳腺導管內，保留腫瘤微環境，更貼近臨床實際情況，應用價值巨大。

發明內容

本發明為了解決現有技術的上述不足，提出了一種乳腺癌PDX構建方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：一種乳腺癌PDX構建方法，包括以下步驟：

1）腫瘤樣本采集：手術中切取腫瘤邊緣生長比較旺盛、無潰瘍壞死的腫瘤組織，迅速裝入含有組織保存液的離心管中，離心管裝入冰包低溫運輸至實驗室。

2）腫瘤樣本處理：在實驗室生物安全柜內用0.4%的臺盼藍染液檢測腫瘤組織活性，剔除沒有活性的組織。然后將組織放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30秒鐘消毒，再用含有3%雙抗的PBS溶液沖洗組織。將沖洗干凈的腫瘤組織放入新的培養皿中，一邊用 7號針頭戳組織，一邊用少量 PBS溶液沖洗，把組織戳成片狀后，再用兩把鑷子擰、擠壓組織，并在 PBS溶液中漂洗，然后收集液體，通過 300 目過濾網過濾。將過濾后的微組織塊懸液收集進15ml離心管，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去離心管內大部分的液體，留取少量培養基懸浮微組織塊備用。