[發明專利]一種乳腺癌PDX構建方法

在審

• 申請號: 201810760063.5
• 申請日: 2018-07-11
• 公開（公告）號: CN110710495A
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發明（設計）人: 何遠橋;陳傳軍
• 申請（專利權）人: 南昌樂悠生物科技有限公司
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種乳腺癌PDX構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）腫瘤樣本采集：手術中切取腫瘤邊緣生長比較旺盛、無潰瘍壞死的腫瘤組織，迅速裝入含有組織保存液的離心管中，離心管裝入冰包低溫運輸至實驗室；

2）腫瘤樣本處理：在實驗室生物安全柜內用0.4%的臺盼藍染液檢測腫瘤組織活性，剔除沒有活性的組織；然后將組織放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30秒鐘消毒，再用含有3%雙抗的PBS溶液沖洗組織；將沖洗干凈的腫瘤組織放入新的培養皿中，一邊用 7號針頭戳組織，一邊用少量 PBS溶液沖洗，把組織戳成片狀后，再用兩把鑷子擰、擠壓組織，并在 PBS溶液中漂洗，然后收集液體，通過 300 目過濾網過濾；將過濾后的微組織塊懸液收集進15ml離心管，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去離心管內大部分的液體，留取少量培養基懸浮微組織塊備用；

3）小鼠接種：在SPF級動物房，選擇成年雌性裸鼠或其他高度免疫缺陷雌性小鼠，麻醉后將小鼠仰臥位固定于手術板上，有毛小鼠需要將腹部毛發剃除干凈，使第4對乳頭完全暴露；0.5%碘伏消毒局部皮膚，借助解剖顯微鏡，用顯微眼科剪將第4對乳頭尖部平剪掉，暴露乳腺導管，用50ul平口Hamilton微量進樣針（30G）吸取20μl混勻的微小組織塊混懸液或者細胞懸液（約10萬細胞/乳頭），緩慢注射進乳腺導管內，0.5%碘伏棉簽消毒創口；

4）小鼠飼養與觀察：將小鼠飼養在SPF級動物房IVC籠具中，常規飼養；每周觀察兩次荷瘤小鼠，用手感觸乳腺質地，并用游標卡尺測量腫瘤大小，記錄腫瘤生長曲線；

5）病理和基因檢測：當腫瘤體積長到1500mm³左右或者表面有潰瘍時，將瘤體手術剝離下來，取一部分進行病理檢測和基因測序，剩余組織一部分放入凍存液中凍存，一部分繼續傳代。

2.根據權利要求1所述的乳腺癌PDX構建方法，其特征在于：在步驟1）中，手術中切取腫瘤邊緣生長比較旺盛、無潰瘍壞死的腫瘤組織，迅速裝入含有組織保存液的離心管中，離心管裝入冰包低溫運輸。

3.根據權利要求1所述的乳腺癌PDX構建方法，其特征在于：在步驟2）中，還需要對乳腺癌組織塊進行分塊處理，具體操作方法是：在實驗室生物安全柜內用0.4%的臺盼藍染液檢測腫瘤組織活性，剔除沒有活性的組織；然后將組織放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30秒鐘消毒，再用含有3%雙抗的PBS溶液沖洗組織；將沖洗干凈的腫瘤組織放入新的培養皿中，一邊用 7號針頭戳組織，一邊用少量 PBS溶液沖洗，把組織戳成片狀后，再用兩把鑷子擰、擠壓組織，并在 PBS溶液中漂洗，然后收集液體，通過 300 目過濾網過濾；將過濾后的微組織塊懸液收集進15ml離心管，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去離心管內大部分的液體，留取少量培養基懸浮微組織塊備用。

4.根據權利要求1所述的乳腺癌PDX構建方法，其特征在于：在步驟3）中，在對小鼠注射時，操作人員用顯微眼科剪將第4對乳頭尖部平剪掉，暴露乳腺導管，用50ul平口Hamilton微量進樣針吸取20μl混勻的微小組織塊混懸液或者細胞懸液（約10萬細胞/乳頭），緩慢注射進乳腺導管內，0.5%碘伏棉簽消毒創口，小鼠常規飼養。

5.根據權利要求4所述的乳腺癌PDX構建方法,其特征在于：在步驟3）中，所述的微組織塊混懸液還可以換成乳腺癌細胞懸液，乳腺癌細胞懸液制備時可以是人源或者鼠源乳腺癌細胞株或細胞系，也可以是人乳腺癌原代細胞，收集乳腺癌細胞后，用培養基將細胞制備成1×10⁶個/ml的細胞懸液。