[發明專利]一種血清中HBV DNA的實時熒光定量檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201810755701.4
• 申請日: 2018-07-11
• 公開（公告）號: CN108796133B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 張曉瑋;林若琳;羅園香;楊芬;石壯壯;彭春梅;張嘉;鄧可基;李家導;陳觀芝;蔡佺佑;蔡培宏;顏道宇;王旭川;黃彩蘭;李思成;邢蘭坤;王星;王法
• 申請（專利權）人: 廣州海力特生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 張黎

本發明公開了一種血清中HBV DNA實時熒光定量檢測試劑盒及其檢測方法，所用的裂解液中通過使用多果定代替傳統的胍鹽和一部分去污劑的使用，有效地對含HBV病毒顆粒的血清樣本進行裂解，釋放其中的HBV DNA，從而顯著的提高了HBV病毒的裂解效率，并大大縮短了檢測時間。

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，具體涉及一種血清中HBV DNA的實時熒光定量檢測試劑盒及其檢測方法

背景技術

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒,是一種DNA病毒，根據目前所知，HBV只對人和猩猩有易感性，引發乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成顆粒狀，也會被稱為丹娜顆粒(Dane)。1965年由丹娜發現，直徑為42納米，顆粒分為外殼和核心兩部分。乙型肝炎病毒(HBV)基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環狀DNA。中國的乙肝病毒感染率約60％-70％，乙肝表面抗原攜帶率約占總人口的7.18％，以此計算，全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。

目前HBV DNA定量的金標準是羅氏公司的Cobas HBV試劑盒，是一種基于Taqman技術的定量PCR方法。這種方法HBV-DNA檢測治療前進行病毒定量檢測，可以選擇針對性的藥品，避免盲目用藥，同時也可直接準確地測定體內病毒數量，有助于判斷治療乙肝的效果。

雖然HBV DNA的熒光定量檢測方法，已經是一種相對成熟的臨床檢測方法，但是該方法具有一些缺點，如操作步驟較多，不僅耗時較長，而且易污染，同時會產生較多的廢棄物，不利于環境的保護。另外，提取試劑引入的抑制劑，以及洗滌步驟中HBV DNA的損失，都會降低試劑的檢出性能。

申請人多年一直致力于HBV檢測試劑盒的研究，已有HBV檢測類的發明專利201410223058.2，其公開了檢測乙型肝炎病毒的PCR引物、引物組、探針以及試劑盒和檢測方法，該發明可檢測出世界范圍內各種不同亞型的乙型肝炎病原體，在血清標本中定量檢測限可達2IU/mL。但該發明采用的DNA裂解液為常規裂解液，操作相對不夠簡單，耗時相對較長。

市面上也有如湖南圣湘生物的一步法的HBV熒光定量方法,如中國專利200910309980.2公開了一種一步法病原體核酸熒光定量PCR檢測方法，針對待測病原體核酸選取保守基因序列，設計特異性引物探針，采用一種核酸快速釋放試劑提取病原體核酸，直接加入相應的PCR反應液，實現PCR熒光定量檢測，該發明操作簡單快速，抗污染抗干擾能力強，提取的核酸無損失，所用試劑制造成本低，但無法對血清中低至20IU/mL的HBV DNA進行準確定量。

多果定(十二烷基胍醋酸鹽，Dodine)，是一種含胍基的特殊表面活性劑。主要作為日化用品類表面活性劑，防治果樹、蔬菜病害，主要為作用保護，而非無內吸。多果定的防治果樹、蔬菜、堅果、觀賞植物和成蔭樹上的多種主要霉菌病害。此外，用于工業水處理劑，洗滌劑，種子處理劑和婦女兒童用品等。

本發明公開了一種實時熒光定量PCR方法，通過使用多果定代替傳統的胍鹽(異硫氰酸胍或鹽酸胍)和一部分去污劑(常用的有Tween-20、Triton X-100、SDS等)的使用，有效地對含有HBV病毒顆粒的血清樣本進行裂解，釋放其中的HBV DNA，并降低對下游實驗的抑制，從而顯著的提高了HBV病毒的裂解效率，并大大縮短了檢測時間。

發明內容

本發明的目的在于提供一種血清中HBV DNA的實時熒光定量檢測試劑盒及其檢測方法。

首先，本發明提供一種血清中HBV DNA的實時熒光定量檢測試劑盒，

該試劑盒包括：

乙型肝炎病毒HBV的檢測引物組；

乙型肝炎病毒HBV的檢測探針；

和裂解液；