[發明專利]一種炎癥標志物聯合定量檢測試紙及其制備方法

有效

• 申請號: 201810746660.2
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN109001464B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 于龍波;于永濤;黎權;劉日俊
• 申請（專利權）人: 廣州華澳生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533
• 代理公司: 蘇州攜智匯佳專利代理事務所(普通合伙) 32278
• 代理人: 溫明霞

1.一種炎癥標志物聯合定量檢測試紙制備方法，包括炎癥標志物抗體標記與制備檢測試紙，所述炎癥標志物抗體標記步驟如下：

①用羧基化聚苯乙烯微球包裹Eu³⁺-Fe₃O₄復合物制備的磁性稀土熒光微球，粒徑200nm，固含量為1％；

②取磁性稀土熒光微球1mL，加入5mL pH 7.0、0.02M 3-(N-瑪琳代)丙磺酸緩沖液，混勻，25000rpm離心10min，棄上清；再加入5mL MOPS，90W超聲，工作2s，間歇5s，重復2次，25000rpm離心10min，棄上清；

③再次加入5mL MOPS，90W超聲，工作2s，間歇5s，重復2次，完成對微球的清洗；

④在清洗后微球中加入15mg EDC和50mg sulfo-NHS，渦旋混勻后，37℃反應15min；

⑤反應完成后，加入2-巰基乙醇8.6μl，終止羧基的活化；

⑥分別加入血清淀粉樣蛋白A、超敏C反應蛋白、降鈣素原對應抗體各1mg，置于旋轉培養箱上，37℃反應90～120min；

⑦然后加入100μL 5％BSA和100μL 1％PEG20000，對未標記的位點進行封閉，置于旋轉培養箱上，37℃反應60min；

⑧反應結束后，將上述液體2000rpm離心15min，棄上清，加入含1％BSA、10％蔗糖、2％海藻糖的pH8.0 0.2M硼酸硼砂緩沖液的保存液5mL，超聲2s；

⑨將標記后的微球稀釋50～100倍，每支200μL分裝，即為單人份半成品；

所述炎癥標志物聯合定量檢測試紙制備步驟：

①用BIODOT三維噴金點膜儀，以1μl/cm參數，在硝酸纖維素膜上包被血清淀粉樣蛋白A、超敏C反應蛋白、降鈣素原相應的抗體三條檢測線，和一條羊抗鼠/羊抗兔IgG質控線，37℃干燥16小時，作為反應膜；

②用含0.5％Tween-20的0.1M PBS溶液浸泡玻璃纖維，然后37℃干燥16小時，裁剪17mm×300mm為作為樣品墊；

③將樣品墊、反應膜和22mm×300mm的吸水紙以層層疊壓的形式黏貼組裝在底板上；

所述炎癥標志物抗體標記步驟①中羧基化聚苯乙烯微球的制備如下：

1.1聚苯乙烯微球種子的制備

1.1.1量取100ml的苯乙烯于分液漏斗中，用1M NaOH洗滌3次，除去苯乙烯中的雜質，然后用純化水洗滌至中性，然后置入干燥皿中干燥24h以上；

1.1.2將氬氣充入反應裝置中，除去裝置中的氧氣；

1.1.3在反應裝置中加入100ml的乙醇，然后加入5g PVP，攪拌30min；

1.1.4加入40ml已洗滌過的苯乙烯和5ml偶氮二異丁腈，水浴升溫至45℃，反應30min，然后將反應溫度升高至75℃，反應12h；

1.1.5反應結束后，用網篩過濾上述反應液，然后用無水乙醇洗滌離心3～5次，然后將初步除雜后的聚合物在40％乙醇中，使其自然沉淀，稱取沉淀重量；

1.2聚苯乙烯表面的羧基化修飾

1.2.1將上述分散所得的聚苯乙烯微球作為種子1g，用10ml 0.25％SDS將其分散；

1.2.2然后在上述體系中加入2倍種子重量的環己烷，35℃溶脹16～18h；

1.2.3稱取0.02g過氧化苯甲酰、量取10μl乙二醇獨甲醚和10μl二甲基苯烯酸乙二醇酯，分別加入至上述反應液中，繼續溶脹12h；

1.2.4溶脹結束后，加入2.5mg PVA，提高反應溫度至75℃，繼續反應10～12h；

1.2.5用乙醇反復洗滌3次，除去未反應的單體和低聚物，然后20000rpm離心沉降微球；

所述炎癥標志物抗體標記步驟①中羧基化聚苯乙烯微球包裹Eu³⁺-Fe₃O₄復合物制備磁性稀土熒光微球的步驟如下：

1.3.1將FeCl₂、FeCl₃、EuCl₃、NaOH溶液，按摩爾比例Fe²⁺：Fe³⁺：Eu³⁺：Na⁺＝1:1:2:5，將其溶液進行混合，攪拌反應，得到沉淀，陳化3～5h后過濾，用純化水洗滌2～3次，干燥、研磨后獲得Eu³⁺-Fe₃O₄復合物。

1.3.2取0.1g羧基化修飾的聚苯乙烯微球，加入至20ml異丙醇中，超聲分散10min；

1.3.3稱取Eu³⁺-Fe³O⁴復合物0.5mg，加入至5ml氯仿中，超聲分散20min；

1.3.4將1.3.2和1.3.3中的兩種液體混合，真空環境中控放置5～6h，然后再置于常壓2～3h；

1.3.5將溶脹后的微球用乙醇洗滌3次，用磁場除去未能成功包裹磁微粒的微球。