[發明專利]一種大豆HRM-SNP分子標記點標記方法及其應用

有效

• 申請號: 201810746214.1
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN108823330B
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 宋江華;裴佳星;董德坤;朱丹華;楊清華
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種大豆HRM?SNP分子標記點標記及其應用，進行大豆SNP標記的開發、浙鮮九號基因組DNA提取、高分辨率熔解曲線過程與分析、浙鮮九號基于HRM技術的SNP分型、浙鮮九號HRM分型驗證、浙鮮九號SNP指紋圖譜的構建。本發明具有高通量、分析時間短：一次可同時完成對96個或384個樣品的分析，適合大規模開發和檢測SNP位點；本發明操作簡便，無需序列特異性探針以及后續測序，只需要設計PCR引物，進行PCR反應，接著直接進行HRM，便可完成對樣品的基因型分析；本發明特異性好：PCR產物無需后續處理，完全閉管操作。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種大豆HRM-SNP分子標記點標記方法及其應用。

背景技術

目前，業內常用的現有技術是這樣的：

到目前為止，進行SNP分型檢測方法已有20多種。依據是否需要凝膠電泳以及自動化程度的高低，可以把SNP的檢測方法大致分為兩大類，一是基于凝膠電泳的SNP檢測方法，像單鏈構象多態性(Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)、變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、裂解擴增多態性序列分析(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS)、等位基因特異PCR(AlleleSpecific PCR，AS-PCR)等；二是高通量、自動化程度較高的SNP檢測方法，像直接測序、DNA芯片、變性高效液相色譜分析技術(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、質譜檢測、高分辨率熔解曲線(High-resolution Melting，HRM)等。

以上檢測SNP方法各有優缺點，有的能精確檢測出SNP位點，如DNA測序、DNA芯片技術，但其成本昂貴，不能普遍運用；有的操作復雜，耗時費力，如AS-PCR技術；有的高通量、成本低、結果準確，但對設備硬件要求較高，如HRM技術。理想的SNP檢測法應具有如下特點：靈敏度以及準確度高；快速、簡便、高通量；費用相對低廉。但到目前為止還沒有完全符合以上特點的檢測方法出現，因此可依據實際情況，選擇較適宜的方法。

大豆是我國主要的油料和經濟作物，已有五千多年的種植歷史。因營養豐富、風味較好、經濟效益高，且采收、加工、銷售等形式多樣化，而風靡中國、日本等亞洲國家。

雖然大豆起源于我國，但發展較晚，早期育種主要以從臺灣省或者日本引進優異品種進行篩選或雜交選育為主，導致育種資源遺傳基礎較窄，不利于新品種的開發。而目前主要用于大豆各類研究的簡單序列重復(SSR，Simple Sequence Repeat)標記，也存在數量相對較少、分析操作復雜、標記大小不易確定而無法跨研究使用等不利因素。

高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)技術是一種新型的SNP檢測技術。近年來，隨著該技術的不斷發展完善，已被成功應用到基因分型、突變掃描、甲基化研究等多個方面，并且在馬鈴薯、苜蓿、柑橘等作物研究中得以成功地應用。因而，開發密度更高、分析更簡便、基因型確定可以跨研究使用的SNP新型分子標記，具有非常重要的應用價值。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

(1)目前主要用于大豆各類研究的簡單序列重復(SSR，Simple Sequence Repeat)標記，也存在數量相對較少、分析操作復雜、標記大小不易確定而無法跨研究使用等不利因素。

(2)由于大豆基因組異常復雜，HRM技術本身對引物設計的要求比較高，在進行引物設的計過程中，經常會遇到SNP位點序列在基因組中不是唯一的、或者設計的引物有非特異擴增的情況。

解決上述技術問題的意義：