[發明專利]一種大豆HRM-SNP分子標記點標記方法及其應用

有效

• 申請號: 201810746214.1
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN108823330B
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 宋江華;裴佳星;董德坤;朱丹華;楊清華
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種大豆HRM-SNP分子標記點標記方法，其特征在于，所述大豆HRM-SNP分子標記點標記方法包括：

大豆SNP標記的開發：使用數據庫中的Genome瀏覽器工具從Williams 82物理圖譜中每10Mb選擇一個SNP標記，每條染色體選擇4～6個SNP，均勻分布于大豆基因組20條染色體上，獲取每個SNP標記的詳細信息，包括dbSNP名稱，SNP位置，SNP等位基因以及上下游121bp基因組序列；

所述SNP標記篩選如下：

所述dbSNP名稱和SNP標記的PCR引物序列為：

大豆基因組DNA提取:根據改進的CTAB法提取大豆幼嫩葉片的基因組DNA，并稀釋至25ng·μL^-1，保存于-20℃冰箱以備后續HRM分析使用；

高分辨率熔解曲線過程與分析：在定量PCR儀上利用SNP標記的PCR引物進行PCR擴增和HRM分析；高分辨率熔解曲線分析采用480軟件的Gene Scanning模塊進行，獲得更好的標準化熔解曲線；

大豆基于HRM技術的SNP分型：大豆DNA在定量PCR儀內進行擴增和HRM分析；

大豆HRM分型驗證：隨機對部分SNP標記的PCR產物進行Sanger測序，驗證HRM分析的準確性；

大豆SNP指紋圖譜的構建：以Williams 82為對照，利用開發的101個SNP標記對菜用大豆進行HRM分型，并將分型結果按照染色體編號－物理圖距從小到大的順序依次列出；

大豆基因組DNA提取中，大豆為浙鮮九號，根據改進的CTAB法提取浙鮮九號幼嫩葉片的基因組DNA，并稀釋至25ng·μL^-1，保存于-20℃冰箱以備后續HRM分析使用，具體步驟包括：

(1)提取緩沖液2％CTAB，100mmol·L^-1Tris-HCL，pH8.0；20mmol·L^-1EDTA；2％PVP；1.4mol·L^-1Nacl，使用前加入0.2％的巰基乙醇，預熱至65℃；

(2)取新鮮葉片0.05g，適當剪碎后放入2.0ml離心管中，加入1顆直徑5mm鋼珠，2～3顆2mm小鋼珠；

(3)在含樣品和鋼珠的離心管中加入1.0mL預熱的提取緩沖液，蓋好離心管蓋，裝入適配器后在TissueLyser-192磨樣機中研磨60秒；

(4)取出離心管，65℃水浴10-30min，然后取出離心管，1200rpm離心5-10min；

(5)取1mL上清液到新的2mL離心管中，加入700μL按體積比酚:氯仿:異戊醇＝25:24:1，緩慢顛倒混勻數次；室溫，1200rpm離心5-10min；

(6)取800μL上清液到新的2mL離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇＝24:1，緩慢顛倒混勻數次；室溫，1200rpm離心5-10min；

(7)取600μL上清液到新的1.5mL離心管中；加入400μL預冷的異丙醇，緩慢顛倒混勻，置于-20℃冰箱放置30min；

(8)室溫，1200rpm離心10min，棄上清；

(9)加入1mL預冷的70％乙醇洗滌DNA，1200rpm離心10min，棄上清；

(10)DNA放入超凈工作臺吹干，加入100-200μL去離子水溶解DNA；

(11)加21μL 0mg/mL RNase 37℃水浴30min；

(12)取5μL DNA，以1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，以及UVS-99微量核酸檢測儀檢測DNA濃度及質量；

高分辨率熔解曲線過程與分析中，

20μL反應體系的組合為：2μL DNA50ng，4μL 5x EVAGreen Realtime PCR Mix，10μmol·L^-1的上、下游引物各0.4μL，其余用水補足；混合體系放置于96孔PCR板內，貼上封板膜瞬時離心，置于儀器內反應；

反應程序是：95℃預變性15min，經過45個常規循環，接著高分辨率熔解，最后產物冷卻至40℃保持10s；

循環程序是95℃15s，60℃20s，72℃20s，共45個循環；

高分辨率熔解過程是：95℃1min，40℃1min，65℃1s，65-95℃讀取熔解曲線，溫度分辨率0.02℃，以每攝氏度25次的速率連續采集熒光信息；

浙鮮九號的SNP圖譜為SEQ ID NO：1：“TCAACT AGCCA CTGCT CCTAG ATGAC CGCGATGGGG TGGGC CACCA TCACT TCTT CTGGT TACCA TACCG TGGCG AGGTC TAAAC GATCTC CTCTGCTACT”。

2.如權利要求1所述的大豆HRM-SNP分子標記點標記方法，其特征在于，

大豆基于HRM技術的SNP分型結果通過熔融峰Melting Peaks、標準化的熔解曲線Normalized Melting Curves、標準化溫度差異視圖NormalizedTemp-ShiftedDifference Plots進行表示。