[發明專利]一種低豐度突變DNA的Loop式富集檢測引物及其應用

在審

• 申請號: 201810744811.0
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN108823285A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 蓋偉;張巖;邢婉麗;宋翠丹;馬桂紅;程京
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛;趙青朵

1.一種低豐度突變DNA的Loop式富集檢測引物，其特征在于，包括上游引物，所述上游引物由輔助引物、連接序列和擴增引物組成，所述輔助引物、連接序列和擴增引物依次連接；

所述輔助引物長度為11-16nt，其上設計有所述突變DNA的突變位點，所述輔助引物與所述突變DNA可完全互補配對，并與所述突變DNA相對應的野生DNA有一個突變堿基的不匹配；

所述擴增引物長度為10-14nt，與所述突變DNA和野生DNA均可完全匹配；

所述輔助引物Tm值高于擴增引物Tm值3℃以上；

所述富集檢測引物與所述突變DNA結合時，所述擴增引物結合區域位于所述輔助引物結合區域的上游，且所述輔助引物的5’末端與所述擴增引物的3’末端在所述突變DNA上的結合位置間隔0-5個堿基；

所述連接序列與所述突變DNA和野生DNA均不結合。

2.根據權利要求1所述富集檢測引物，其特征在于，所述連接序列由Oligo(dT)和C12Spacer組成。

3.根據權利要求2所述富集檢測引物，其特征在于，所述Oligo(dT)聚合度為25-35nt。

4.根據權利要求1所述富集檢測引物，其特征在于，所述輔助引物長度為11-16nt，其上設計有突變EGFR的突變位點，所述輔助引物與突變的EGFR可完全互補配對，并與野生EGFR有一個突變堿基的不匹配；

所述擴增引物長度為10-14nt，與所述突變的EGFR和野生的EGFR均可完全匹配。

5.根據權利要求4所述富集檢測引物，其特征在于，所述輔助引物長度為11-16nt，其上設計有突變EGFR的T790M突變位點，所述輔助引物與突變EGFR可完全互補配對，并與野生EGFR有一個突變堿基的不匹配；

所述擴增引物長度為10-14nt，與所述突變EGFR和野生EGFR均可完全匹配。

6.根據權利要求5所述富集檢測引物，其特征在于，所述輔助引物的序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根據權利要求5所述富集檢測引物，其特征在于，所述擴增引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

8.根據權利要求4所述富集檢測引物，其特征在于，所述輔助引物長度為11-16nt，其上設計有突變EGFR的L858R突變位點，所述輔助引物與突變EGFR可完全互補配對，并與野生EGFR有一個突變堿基的不匹配；

所述擴增引物長度為10-14nt，與所述突變EGFR和野生EGFR均可完全匹配。

9.根據權利要求8所述富集檢測引物，其特征在于，所述輔助引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

10.根據權利要求8所述富集檢測引物，其特征在于，所述擴增引物的序列如SEQ IDNO:4所示。

11.根據權利要求1-10任意一項所述富集檢測引物，其特征在于，還包括下游引物。

12.根據權利要求11所述富集檢測引物，其特征在于，當輔助引物上設計有突變EGFR的T790M突變位點時，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示。

13.根據權利要求11所述富集檢測引物，其特征在于，當輔助引物上設計有突變EGFR的L858R突變位點時，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

14.權利要求1-13任意一項所述富集檢測引物在檢測突變DNA和/或制備檢測突變DNA試劑盒中的應用。

15.一種檢測低豐度突變DNA的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-13任意一項所述富集檢測引物。