[發明專利]一種低豐度突變DNA的Loop式富集檢測引物及其應用

在審

• 申請號: 201810744811.0
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN108823285A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 蓋偉;張巖;邢婉麗;宋翠丹;馬桂紅;程京
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛;趙青朵

本發明涉及生物技術領域，公開了一種低豐度突變DNA的Loop式富集檢測引物及其應用。本發明通過一段Loop式結構連接兩段短的核苷酸序列，利用堿基堆積作用達到突變型和野生型的差異擴增，可將濃度低至萬分之一的突變富集至百分之一～十分之一，達到Sanger測序的檢測范圍，使其可與Sanger測序相結合進行低豐度突變的檢測。本發明適用于突變含量低的外周血游離DNA的檢測，具有采樣簡單、方便，對病患造成的痛苦少，該檢測技術具有特異性好、靈敏度度高、操作簡單，檢測周期短，檢測成本低等優點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說是涉及一種低豐度突變DNA的Loop式富集檢測引物及其應用。

背景技術

檢測生物樣本中DNA突變或微量等位基因在腫瘤診斷、篩查和預后檢測等領域具有重要意義。目前基于PCR檢測DNA突變的技術主要有ARMS-PCR技術(amplificationrefractory mutation system PCR)、基于酶切的PCR富集技術、基于連接的PCR富集技術、基于Blocker阻礙的PCR富集技術、低變性溫度的復合PCR富集技術(co-amplification atlower denaturation temperature PCR，COLD-PCR)以及Digital PCR技術等。

由于有些晚期癌癥患者，比如晚期肺癌患者的組織樣本難以獲取，對其檢測造成一定的局限性，因此需要找到更易于獲取的標本進行檢測，如外周血循環DNA的檢測。基于外周血循環DNA與相應的原發性腫瘤細胞在遺傳特異性上相一致，可以將其作為腫瘤診斷、篩查和預后檢測等的檢測指標，因此，外周血游離DNA的檢測成為目前研究的熱點。

然而，外周血循環DNA中突變核酸含量較低，以肺癌表皮生長因子受體(EGFR)突變檢測為例，Sanger測序和ARMS-PCR法這兩種方法的靈敏度均較低，測序僅能檢測出5％以上的EGFR單堿基位點突變，ARMS-PCR法可檢測十分之一～千分之一的EGFR單堿基位點突變，采用Sanger測序和ARMS-PCR法均難以檢測出突變。這就需要一種檢測靈敏度高的檢測技術，目前常用的是Digital PCR，該技術可檢測千分之一～十萬分之一的突變，但該技術依賴特定儀器進行檢測，檢測成本高昂。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種低豐度突變DNA的Loop式富集檢測引物，特別是用于檢測EGFR突變中的L858R和T790M突變的富集檢測引物，使得所述引物靈敏度高、特異性好，并且可有效的富集并檢測出樣本中低至萬分之一的突變，可將萬分之一的突變模板富集100～1000倍以上；

本發明的另外一個目的在于提供包括所述富集檢測引物的檢測試劑盒，適用于普通PCR和實時熒光定量PCR，特別是應用在EGFR突變中的L858R和T790M突變檢測中；

本發明的另外一個目的在于提供使用所述富集檢測引物檢測低豐度DNA的方法，適用于普通PCR和實時熒光定量PCR，特別是應用在EGFR突變中的L858R和T790M突變檢測中。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種低豐度突變DNA的Loop式富集檢測引物，包括上游引物，所述上游引物由輔助引物、連接序列和擴增引物組成，所述輔助引物、連接序列和擴增引物依次連接；

所述輔助引物長度為11-16nt，其上設計有所述突變DNA的突變位點，所述輔助引物與所述突變DNA可完全互補配對，并與所述突變DNA相對應的野生DNA有一個突變堿基的不匹配；

所述擴增引物長度為10-14nt，與所述突變DNA和野生DNA均可完全匹配；

所述輔助引物Tm值高于擴增引物Tm值3℃以上；優選為高于3-10℃，更優選為高于3-5℃；在具體實施方式中，可選擇為高于3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。