[發明專利]一種雙孢蘑菇菌株及其選育方法

在審

• 申請號: 201810736657.2
• 申請日: 2018-07-06
• 公開（公告）號: CN108865899A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 王金斌;唐雪明;李文;李正鵬;蔣瑋
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01H15/00;C12N15/04;C12Q1/6895;C12R1/645
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種雙孢蘑菇菌株，其生物保藏號為：CCTCC NO：M2017244。

2.根據權利要求1所述雙孢蘑菇菌株，其特征在于，所述雙孢蘑菇菌株菌落9d長滿平板，平板菌絲為白色，形成的原基數為151-202個/m²，成熟子實體菌蓋為棕色，工廠化栽培單位面積產量在26kg/m²以上。

3.一種雙孢蘑菇菌株的選育方法，包括如下步驟：

1)構建突變體庫

在棕色雙孢蘑菇的突變體中，篩選出生長速率快、生長健壯、菌絲較密的單菌株，構建菌株突變體庫；

2)原生質體滅活及篩選融合條件

將菌株突變體庫中的菌株制備為原生質體，并進行雙滅活；

將雙滅活的原生質體離心，去上清，收集沉淀，懸浮，加入預熱的PEG融合劑，進行融合，再生，根據褐色雙孢蘑菇原生質體融合率，在PEG融合劑濃度25-45wt.％、融合劑pH6.5-8.5、融合時間10-40min、融合溫度25-31℃的范圍內篩選出最優融合條件；

3)基因組重排

以突變體菌株作為第一輪基因組重排的親本，制備為原生質體，并進行雙滅活，按照步驟2)中確定的最優融合條件進行融合；

原生質體融合結束后，離心沉淀原生質體并洗滌，去除PEG融合劑，懸浮于滲透壓穩定劑中，涂布至再生平板，于25±0.5℃恒溫培養5～7d進行再生；

以出發菌株作為對照，挑取生長速度快、菌絲濃密的菌株作為F₁代陽性棕色雙孢蘑菇重排菌株；

再以F₁代陽性棕色雙孢蘑菇重排菌株為第二輪基因組重排的親本，按第一輪基因組重排的方法，進行第二輪原生質體融合、再生、挑取生長速度快、菌絲濃密的菌株，獲得F₂代陽性棕色雙孢蘑菇重排菌株；

共進行5輪循環原生質體融合、再生、生長性狀篩選的過程，選出每代仍然能生長的重排菌株，分別標記為GS1、GS2、GS3、GS4、GS5代重排菌株；

4)篩選

將篩選得到的GS4和GS5重排菌株連續轉接培養4-10代，選出到第4-10代還保持平板生長性能良好、菌絲濃密、生長速度快、遺傳性穩定的基因組重排菌株菌株，作為雙孢蘑菇菌株；

5)鑒定

利用相關序列擴增多態性DNA法對獲得的雙孢蘑菇菌株進行基因重排鑒定。

4.根據權利要求3所述雙孢蘑菇菌株的選育方法，其特征在于，所述雙滅活為紫外線滅活和熱滅活兩種滅活方式。

5.根據權利要求3所述雙孢蘑菇菌株的選育方法，其特征在于，步驟2)中篩選出的最優融合條件為：PEG終濃度35％、融合劑pH8.5、融合時間30min、融合溫度25℃。

6.根據權利要求3所述雙孢蘑菇菌株的選育方法，其特征在于，所述滲透壓穩定劑為0.4-0.6mo1/L的甘露醇溶液。

7.根據權利要求3所述雙孢蘑菇菌株的選育方法，其特征在于，所述出發菌株為棕秀一號。