[發明專利]一種快速觀察翠竹胚囊結構的方法

在審

• 申請號: 201810735099.8
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN108872174A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 林樹燕;范婷婷;王星;傅華君;萬雅雯;蘇佳露;楊雅運;丁雨龍
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種快速觀察翠竹胚囊結構的方法，包括取樣→染色→透明→觀察等步驟。本發明利用整體染色透明激光共聚焦顯微技術，快速觀察翠竹胚囊發育，先將翠竹的子房在水楊酸甲酯中透明后，以便觀察到包藏在其中的胚囊，再用激光掃描共聚焦顯微鏡對翠竹子房各層分別成像，獲得胚囊內部清晰的熒光圖像，建立胚囊整體結構概念，明確翠竹胚囊發育過程和發育類型，是一種方便快速的竹類植物胚囊結構觀察技術，具有觀察省時，操作簡便，結構清晰等優勢，有效解決了竹類植物子房胚囊在發育過程中難以觀察到整體結構的問題，為建立和豐富完善竹類植物生殖生物學理論奠定基礎。

技術領域

本發明屬于植物結構發育技術領域，具體涉及一種利用整體染色透明激光共聚焦顯微技術快速觀察翠竹胚囊結構的方法。

背景技術

翠竹(Pleioblastus pygmaeus)是禾本科(Poaceae)苦竹屬(Pleioblastus)的優良地被類觀賞植物，其抗逆性強，耐修剪，目前在園林綠化上的應用需求越來越大，其經濟價值也越來越高[張春霞，駱仁祥，丁興萃等.翠竹的組織培養和快速繁殖[J].植物生理學通訊，2010，46(5)：477-478]。翠竹原產日本，于20世紀80年代由南京古林苗圃引入南京林業大學，2015年3月首次在南京開花，5月果實成熟[林樹燕，范婷婷，姜明云，等3種(品種)地被竹花器官形態特征及學名訂正[J].南京林業大學學報(自然科學版)，2017，41(1)：189-193]。

對胚囊結構和功能的研究一直是植物生殖生物學一個重要的研究內容，但是因為胚囊處于胚珠組織的層層包裹之中，研究工作實施起來十分的困難。常規石蠟切片是研究胚囊的傳統方法，但其制片過程復雜、工作量大。激光掃描共聚焦顯微鏡是近代發展起來用以研究細胞生物學的高科技產品，具有較高的分辨率，能深度識別生物標本中的細微結構，直接地進行形態學觀察，對樣品各層分別掃描成像，用計算機進行圖像處理，建立樣品的三維立體結構圖。用激光共聚焦顯微鏡觀察擬南芥(Arabidopsis thallana)胚珠的發育過程，取得了理想的效果；張華華[張華華，馮九煥，盧永根，等.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察水稻胚囊形成與發育的方法.電子顯微學報，2003，22(5)：380-384.]及郭海濱[郭海濱，盧永根，馮九煥，等.利用激光掃描共聚焦顯微術對同源四倍體水稻胚囊形成與發育的進一步觀察.激光生物學報，2006，15(2)：111-117]等人已利用激光掃描共聚焦顯微技術對同源四倍體水稻的胚囊進行比較研究，并且建立了整體染色透明激光掃描共聚焦顯微術觀察胚囊的方法。徐川梅等人[徐川梅，高欣，湯定欽.利用激光共聚焦顯微鏡研究孝順竹花粉粒發育.林業科學，2010，46(11)：158-161]利用激光共聚焦顯微鏡研究了孝順竹雄配子體發育過程，觀察花粉內部的結構細節，建立了花粉粒三維立體圖。目前還未檢索到激光掃描共聚焦顯微術在竹類植物胚囊結構觀察中的應用。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種快速觀察翠竹胚囊結構的方法，克服石蠟切片費事費力且不容易觀察到目標結構等問題，具有快速、操作簡便等優點。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種快速觀察翠竹胚囊結構的方法，包括以下步驟：

1)取不同發育時期的小穗，固定后，轉移至酒精中永久保存；

2)梯度復水后，曙紅溶液染色，蒸餾水水洗，再以梯度酒精脫水，無水乙醇中重復數次；

3)將染色好的子房置于水楊酸甲酯和酒精的混合液中過渡，隨后轉移到純水楊酸甲酯溶液中透明，最后將樣品保存于純水楊酸甲酯中；

4)將樣品置于凹玻片之上，在凹玻片上加少許的水楊酸以及中性樹脂，用以封片；在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行分層掃描并獲取圖像，觀察出翠竹胚囊結構。