[發明專利]一種快速觀察翠竹胚囊結構的方法在審
| 申請號： | 201810735099.8 | 申請日： | 2018-07-05 |
| 公開（公告）號： | CN108872174A | 公開（公告）日： | 2018-11-23 |
| 發明（設計）人： | 林樹燕;范婷婷;王星;傅華君;萬雅雯;蘇佳露;楊雅運;丁雨龍 | 申請（專利權）人： | 南京林業大學 |
| 主分類號： | G01N21/64 | 分類號： | G01N21/64 |
| 代理公司： | 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274 | 代理人： | 邱興天 |
| 地址： | 210037 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 胚囊 觀察 子房 胚囊結構 竹類植物 發育過程 激光掃描共聚焦顯微鏡 發育 生殖生物學 水楊酸甲酯 透明激光 顯微技術 熒光圖像 有效解決 整體染色 包藏 透明 共聚焦 清晰 染色 取樣 省時 成像 | ||
1.一種快速觀察翠竹胚囊結構的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)取不同發育時期的小穗，固定后，轉移至酒精中永久保存；
2)梯度復水后，曙紅溶液染色，蒸餾水水洗，再以梯度酒精脫水，無水乙醇中重復數次；
3)將染色好的子房置于水楊酸甲酯和酒精的混合液中過渡，隨后轉移到純水楊酸甲酯溶液中透明，最后將樣品保存于純水楊酸甲酯中；
4)將樣品置于凹玻片之上，在凹玻片上加少許的水楊酸以及中性樹脂，用以封片；在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行分層掃描并獲取圖像，觀察出翠竹胚囊結構。
2.根據權利要求1所述的快速觀察翠竹胚囊結構的方法，其特征在于，步驟1)中，取從孢原細胞開始至成熟胚囊的不同發育時期的小花，固定于70％的FAA之中，體視鏡下解剖前從FAA中取出，先用50％的酒精沖洗，隨后轉移至70％的酒精中備用；在體視鏡下解剖分離出發育各階段子房。
3.根據權利要求1所述的快速觀察翠竹胚囊結構的方法，其特征在于，步驟2)中，經70％酒精-50％酒精-30％酒精-15％酒精-蒸餾水梯度復水，每級30min，隨后在10mg/L的曙紅染色12-15h；染色結束后用蒸餾水水洗5次；經梯度酒精脫水，每級30min。
4.根據權利要求3所述的快速觀察翠竹胚囊結構的方法，其特征在于，步驟2)中，梯度酒精為：15％酒精-30％酒精一50％酒精-70％酒精-80％酒精-95％酒精-無水乙醇，無水乙醇中重復3次，每級30min。
5.根據權利要求1所述的快速觀察翠竹胚囊結構的方法，其特征在于，步驟3)中，將染色好的樣品于水楊酸甲酯和酒精的混合液中停留1h，隨后轉入純水楊酸甲酯溶液中透明3次，每次2h，最后將樣品保存于純水楊酸甲酯中，置于4℃冰箱中備用。
6.根據權利要求5所述的快速觀察翠竹胚囊結構的方法，其特征在于，水楊酸甲酯和酒精的體積比為1∶1。
7.根據權利要求1或4所述的快速觀察翠竹胚囊結構的方法，其特征在于，步驟4)中，在Leica SP2激光掃描共聚焦顯微鏡下用543nm的波長激發的熒光，用2μm的光切片厚度進行分層掃描并獲取圖像。
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