[發明專利]單鏈環狀核酸及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810734128.9
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN109161572B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 梁興國;安然;崔一笑
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 肖麗

本發明提供了一種單鏈環狀核酸及其制備方法和應用，涉及分子生物學技術領域，本發明提供的環狀核酸的制備方法，包括具有末端發夾結構的線性核酸在與成環輔助鏈雜交后，經連接酶連接使兩端閉合，得到單鏈環狀核酸。該方法顯著降低了副產物的生成。運用這種“末端發夾”連接方法，使線性核酸在連接酶連接下，在常規體系中的單環成環率可達近100％。并且，大多數的核酸單鏈在連接體系中均會形成發夾結構，所以本發明提供的制備方法的通用性極高。此外，該方法操作簡單，耗時較短，無需專門的實驗人員即可進行操作，在節約人力及時間成本的基礎上，還具有普適性廣的優點。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其是涉及一種單鏈環狀核酸及其制備方法和應用。

背景技術

核酸不僅僅是遺傳信息的載體，也是一種構建納米結構的材料，特別是近些年來，核酸機器的設計成為了研究熱點，不同的核酸機器可呈現“網籠”、“鏈鎖”等形狀，其有可能用于藥物載體、物質運輸、液體計算等方面。單鏈環狀核酸是一種由單鏈DNA、RNA或其他修飾核酸鏈首尾相接形成的環狀將結構，由于其獨特的動力學和拓撲學性質使其在構建納米材料時起到了重要作用。此外，環狀核酸除了可以用于構建納米材料外，也可用于滾環擴增、食品溯源及核酸拓撲結構的研究等。所以，單鏈線性核酸能否環化成功或者線性核酸環化后能夠得到單一的環狀核酸產物成為當前研究的焦點。

當前，大多數單鏈環狀核酸的合成，是在連接酶、成環輔助鏈(與單鏈DNA或RNA的3’和5’末端互補的短鏈)的作用下，首尾相連成為閉合的環(如圖1途徑①)。然而，單鏈環狀核酸制備過程中面臨的主要問題是難以抑制高底物濃度下分子間連接產生的副產物。比如說在反應體系中，多條模板單鏈在成環輔助鏈作用下相互連接(如圖1途徑②)，形成多聚物，即在連接底物的濃度較高的情況下，體系內分子間距離拉近，使分子間的碰撞幾率增大，而線性核酸兩端分子內的碰撞幾率不變，分子間與分子內的碰撞幾率差別變小，最終導致分子間連接效率的增高，多聚物產量急劇增加。最近，對于高濃度連接會產生大量副產物的問題，已有實驗證明在低buffer濃度的條件下能夠有效減少連環過程中的副產物，其低buffer就是降低了反應效率，使分子間的連接效率大幅下降，使分子內的連接處于優勢，但是其存在操作繁瑣，耗時較長等缺點。

因此，開發一種能夠有效使線性核酸連接為環狀核酸，且連接效率高、副產物少，操作簡單、耗時短的環狀核酸的制備方法尤為重要。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種單鏈環狀核酸的制備方法，以緩解現有技術中存在的單鏈環狀核酸連接效率低、副產物較多或操作繁瑣，耗時較長的技術問題。

本發明的第二個目的在于由上述方法制備得到的單鏈環狀核酸。

本發明的第三個目的在于提供上述單鏈環狀核酸在構建納米材料、滾環擴增、食品溯源或核酸拓撲結構研究中的一種或多種中的應用。

本發明提供了一種單鏈環狀核酸的制備方法，所述制備方法包括：

經連接酶連接，使與成環輔助鏈雜交后的線性核酸兩端閉合，得到所述環狀核酸；

其中，所述線性核酸具有發夾結構，所述發夾結構位于所述線性核酸與所述成環輔助鏈的連接處；

所述成環輔助鏈與所述線性核酸的3’端和5’端互補。

進一步地，將所述線性核酸進行二級結構模擬，選擇穩定的發夾結構作為所述線性核酸與所述成環輔助鏈的連接處。

進一步地，所述線性核酸的長度為40-200nt，優選為44-200nt，更優選為54-200nt。

進一步地，所述發夾結構的T_m值高于連接反應溫度10-60℃，優選為高于連接反應溫度20-40℃。