[發明專利]一種高通量的單細胞轉錄組測序方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201810732719.2
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN110684829A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 趙星;金皓玄;李羅權;趙小瑩;馮太青;齊曉娟;周清;李貴波;李計廣;王磊;李陽
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 44281 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 李小焦;彭家恩

本申請公開了一種高通量的單細胞轉錄組測序方法和試劑盒。本申請的高通量單細胞轉錄組測序方法，包括采用液滴生成系統將單細胞與帶有標簽的微珠包裹在一個液滴中，并在液滴中進行逆轉錄。本申請的方法，通量可達9000個細胞，與10×genomics相當，液滴破乳之后微珠相互污染小，提高了有效數據占比。本申請的方法在液滴中進行逆轉錄，所需試劑少，成本低。本申請的優選方案中，逆轉錄采用SMART模板轉換技術，其產物可以直接用于后續的Tn5文庫構建以及BGISeq?500平臺測序，無需進行文庫轉化；避免了多次擴增引入偏差，實現了液滴微流控平臺與BGISeq?500測序平臺連用，簡化并方便了大規模單細胞測序。

技術領域

本申請涉及單細胞測序領域，特別是涉及一種高通量的單細胞轉錄組測序方法和試劑盒。

背景技術

疾病發生機制和他們的檢測預防主要是通過對細胞基因組變異、轉錄組異常表達的檢測來進行分析。而單細胞測序技術能夠揭示組織內細胞復雜的異質性，為疾病的診斷和治療提供精準的信息。受制于單細胞測序技術的處理通量和成本等問題，很多大規模的研究工作無法展開，微流控技術和單細胞測序技術相結合可以很好地解決這些問題；同時單分子測序技術能夠避免核酸擴增所引起的誤差，在基礎科研和臨床醫學研究中具有極大的應用前景和需求。

美國Fludigm公司于2014年推出的C1單細胞全自動系統，該儀器通量已提升到一次可以分析數百個單細胞。該系統的出現成為全世界單細胞研究課題組關注的焦點。但是，Fluidigm的C1系統，使用微閥區分單細胞，由于芯片上的腔室有限，通量較低，目前最多只能做938個細胞，且成本高。

Wafergen系統，使用微孔芯片和機械臂實現單細胞的分離，微孔數量72*72，相對于Fluidigm的C1系統，Wafergen系統通量可以達到1000-2000個細胞；但是，通量仍然較低，不能很好的滿足大規模研究工作的使用需求；而且，Wafergen系統反應體系龐大，導致消耗試劑多、成本高、對樣本損耗量大。

相較于Fludigm的C1系統和Wafergen系統，基于液滴微流控原理的10×genomics和Dolomite通量更高，利用微流控芯片將帶有標簽的微珠和單細胞包裹在一個液滴中，實現單細胞的分離與標記，可以同時對上萬個細胞進行分析。但是，Dolomite系統在破乳的時候，微珠上空載的引物容易結合游離mRNA，交叉污染大；形成的文庫無法直接環化，不能直接連用BGISeq-500平臺；需要額外的文庫轉換，引入數據偏差，降低數據有效使用率。而10×genomics對樣本要求高，成本高；形成的文庫也無法直接環化，不能直接連用BGISeq-500平臺；同樣的，需要額外的文庫轉換，引入數據偏差，降低數據有效使用率。

此外還有一些單細胞分離技術，例如口吸管、流式細胞儀等。但是，口吸管，顯微操作，該方法通量低，耗時長，過程繁瑣。流式細胞儀樣本需求量大，需要精準控制，并且，對細胞有損傷，對后續建庫要求高。

總的來說，目前現有的單細胞分離或單細胞轉錄組測序技術，受制于通量、成本等問題，很多大規模的研究工作無法展開。一方面，通量低較難實現細胞異質性和不同細胞亞群的細致分析。另一方面，提高通量后導致的雙包率增高，成為目前高通量平臺的一個瓶頸。

發明內容

本申請的目的是提供一種新的高通量的單細胞轉錄組測序方法和試劑盒。

本申請具體采用了以下技術方案：

本申請的第一方面公開了一種高通量的單細胞轉錄組測序方法，包括采用液滴生成系統將單細胞與帶有標簽的微珠包裹在一個液滴中，并且，在液滴中進行逆轉錄獲得第一鏈cDNA。