[發明專利]一種高通量的單細胞轉錄組測序方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201810732719.2
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN110684829A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 趙星;金皓玄;李羅權;趙小瑩;馮太青;齊曉娟;周清;李貴波;李計廣;王磊;李陽
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 44281 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 李小焦;彭家恩

1.一種高通量的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：包括采用液滴生成系統將單細胞與帶有標簽的微珠包裹在一個液滴中，并且，在所述液滴中進行逆轉錄獲得第一鏈cDNA。

2.根據權利要求1所述的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：所述逆轉錄采用SMART模板轉換技術在mRNA的逆轉錄本第一鏈cDNA的5’端引入堿基，以區分于3’端序列。

3.根據權利要求2所述的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：還包括采用SMART PCRPRIMER對SMART模板轉換產物進行SMART PCR預擴增，擴增獲得3’端標記序列；其中，SMARTPCR PRIMER為3’端的特異性引物。

4.根據權利要求3所述的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：所述SMART PCR PRIMER為SEQ ID NO.1所示序列；

SEQ ID NO.1：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。

5.根據權利要求3所述的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：還包括采用針對所述3’端標記序列的特異性引物組對所述3’端標記序列進行PCR擴增富集，然后對PCR擴增富集產物進行片段選擇，將選擇的片段環化后，直接采用BGISeq-500平臺測序。

6.根據權利要求5所述的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：所述特異性引物組的上游引物為SEQ ID NO.2所示序列，下游引物為SEQ ID NO.3所示序列，并且，上游引物的5’端具有磷酸化修飾；

SEQ ID NO.2：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’

SEQ ID NO.3：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCGTCTCGTGGGCTCGG-3’

片段環化采用的Splint oligo為SEQ ID NO.4所示序列，

SEQ ID NO.4：5’-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3’

其中，SEQ ID NO.2所示序列的上游引物的末位兩個堿基進行硫代修飾。

7.根據權利要求1-6任一項所述的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：所述逆轉錄中，1mL的反應液包括10％Triton-X 10μL、0.1M DTT 125μL、RnaseOUT 75μL、10Mm eachdNTPs 50μL、5×RT buffer 400μL、Super Script II Reverse Transcriptase 75μL、Template Switch Oligo 20μL、Rnase-free H₂O 265μL；逆轉錄的反應條件為，37℃30min、65℃60min、4℃待機。

8.根據權利要求7所述的單細胞轉錄組測序方法，其特征在于：所述Template SwitchOligo為SEQ ID NO.5所示序列，

SEQ ID NO.5：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATGGG-3’

SEQ ID NO.5所示序列的Template Switch Oligo中，倒數第2和第3位堿基進行核糖鳥嘌呤核苷修飾，末位堿基進行LNA修飾。